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西藏开菲尔粒(TKGs),俗称“西藏灵菇”,主要是由多种乳酸菌、酵母菌共生在一起,偶尔有醋酸菌,并以乳酸菌为优势菌形成的复杂共生体。本文采用PCR-DGGE技术、克隆文库法、宏基因组测序技术、荧光定量PCR技术、扫描电镜,SYBRGreen I染色、荧光原位杂交(FISH)等方法对西藏开菲尔粒中微生物基因组的提取、细菌与酵母菌的菌群多样性、两株乳酸菌的分离鉴定及其形态分布进行研究,为进一步认识西藏开菲尔粒形成机制,探讨其微生物之间共生机制奠定基础。1.对西藏开菲尔粒微生物基因组提取的研究。采用实验室备有的两种基因组提取试剂盒(天根试剂盒与凯杰试剂盒)给出的提取组织中的基因组的实验方案在未做优化的前提下都做提取西藏开菲尔粒中微生物基因组的预实验,结果均不理想,在添加修改即同时添加溶菌酶与溶壁酶处理后,用两种试剂盒来提取西藏开菲尔粒中微生物基因组都可以成功,电泳检测结果明显显示天根试剂盒提取的基因组要较凯杰试剂盒提取到的基因组条带清晰,且用Real-time q PCR试验定量时能够获得高的模板基因拷贝数。因而在提取西藏开菲尔粒微生物总基因组方面,天根试剂盒较凯杰试剂盒更有优势,同时天根试剂盒在价格方面也较凯杰试剂盒便宜很多,节约了实验成本。2.对西藏开菲尔粒中微生物的数量随着培养时间的变化研究中运用q PCR技术进行检测定量,微生物的基因拷贝数代表微生物的数量变化,四个培养时间点1周、4周、8周与12周分别取样定量其中细菌与酵母菌的数量发现,虽然培养时间增长,但是相同质量的西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌的数量无明显差异。3.采用DGGE、克隆文库、宏基因组分析方法对西藏开菲尔粒中细菌的多样性研究中得到,西藏开菲尔粒中细菌的多样性比较单一,80%的菌种属于Firmicutes,其中优势菌种为Lb.kefiranofaciens,采集4种样品进行细菌多样性实验,S8、N8与S6、N6样品结果展示细菌多样性没有明显差别。其中自然培养与无菌培养两种培养方式下Lb.kefiranofaciens都是优势细菌,相差10个月培养时间里,Lb.kefiranofaciens的优势地位没有改变,表明Lb.kefiranofaciens稳定存在于西藏开菲尔粒中。4.采用纯培养与PCR鉴定的方法从西藏开菲尔粒中成功分离鉴定出Lb.kefiranofaciens与Lb.kefiri两株乳酸菌种。SEM的结果显示Lb.kefiranofaciens为长杆菌直径为1.0~10μm;Lb.kefiri为短杆菌,直径为0.5~2μm。SYBRGreen I染色结果与SEM结果一致。同时发现培养7天的Lb.kefiranofaciens较培养5天的Lb.kefiranofaciens形态要长,而培养7天与5天的Lb.kefiri自身形态上没有变化。对西藏开菲尔粒中Lb.kefiranofaciens的分布研究FISH实验中得到Lb.kefiranofaciens在西藏开菲尔粒中有两种形态存在,外部与内部具有不同的形态特征,外部为杆状菌,内部为长弯曲状菌。5.对西藏开菲尔粒的培养过程中添加核黄素VB2与两性霉素B(AMB)两种试剂来试图破坏西藏开菲尔粒中微生物的共生机制来使得西藏开菲尔粒解体的角度探究西藏开菲尔粒的形成机理,通过SYBRGreen I染色,荧光原位杂交,荧光定量PCR技术检测,结果显示西藏开菲尔粒在用VB2处理培养过程中,细菌与酵母菌的共生关系依然存在,数量与自然培养的相比,无明显差别。在用AMB处理培养西藏开菲尔粒的过程中,西藏开菲尔粒的外观结构较自然培养变得松散。SYBRGreen I染色观察显示酵母菌的数量明显减少,但酵母菌并没有被完全消失,仍有部分酵母菌存在,因而西藏开菲尔粒的共生体并没有完全被破坏。采用DGGE对实验室内多种培养方式的西藏开菲尔粒中酵母菌的多样性进行分析,结果表明三类酵母菌的确为西藏开菲尔粒中的优势酵母菌,且其他种类的酵母菌在DGGE中并没有发现。6.总的来说,西藏开菲尔粒细菌的多样性比较单一,Lb.kefiranofaciens为主要的优势菌种且稳定存在于西藏开菲尔粒中,培养方式的改变与培养时间不同并不会改变Lb.kefiranofaciens为优势菌种的地位与稳定性,也证实了TKGs是相对稳定的结构,能够在与外界微生物的不断竞争环境中稳定生长与存在。对Lb.kefiranofaciens形态特征的研究中发现纯培养的Lb.kefiranofaciens与西藏开菲尔粒中的Lb.kefiranofaciens具有不同的形态结构,纯培养条件下Lb.kefiranofaciens是明显的杆状细菌,而在西藏开菲尔粒中Lb.kefiranofaciens具有两种不同的形态特征。这种差别可能是生存环境的不同导致的。纯培养时营养物质丰富,且分布均匀,而且只有Lb.kefiranofaciens单一菌种,而西藏开菲尔粒在牛奶中培养时内部与外部菌群的生存环境不一样,外部菌群更容易摄取营养物质,同时不仅只是存在Lb.kefiranofaciens单一菌种还有类似酵母菌等真核微生物的存在。这些不同导致了Lb.kefiranofaciens最终形态的不同。西藏开菲尔粒这种共生系统可能是由于西藏开菲尔粒中微生物群落之间长期的互利共生作用而形成的;其中酵母菌群多样性及分布特征的差异主要取决于用于培养的牛奶和培养条件。这些研究结果为进一步研究TKGs中微生物之间具体的共生机制以及西藏开菲尔粒形成机制奠定基础。