小麦TaDOF1和TaDOF2基因克隆及其功能分析

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转录因子在基因的转录调控中扮演着非常重要的角色。DOF蛋白是植物特有的转录因子,因其N端包含一个C2-C2锌指结构,因此被称之为DOF(DNA binding with one finger)。DOF蛋白主要含有两个重要的结构域,即N端的保守结构域和C端的转录激活/抑制结构域。N端的保守结构域不仅具有和DNA以及蛋白质结合的双重功能而且还含有核定位序列(Nuclear localization signal,NLS),除此之外,DOF蛋白还含有一定数量的寡聚化位点。据报道DOF类转录因子在植物的生长发育以及抵御外界胁迫时参与多种生物过程,发挥着重要功能,但其在小麦等作物中的功能还不明确。本论文中,我们克隆了两个小麦DOF基因,Ta DOF1和Ta DOF2,并对其功能进行了初步研究,取得的研究结果如下:1.通过q RT-PCR技术,构建了Ta DOF1和Ta DOF2的组织表达谱和诱导表达谱。结果显示,在孕穗期以前,Ta DOF1主要在叶中表达,而孕穗期以后Ta DOF1表达相对普遍,在各个组织中表达量普遍较高,而Ta DOF2则在根中表达比较活跃。Ta DOF1在经过激素乙烯利(ETH)和脱落酸(ABA)处理、盐胁迫Na Cl处理以及甲基紫精(MV)氧化胁迫后,相对表达量会略微升高,在经过生长素(IAA)以及茉莉酸甲酯(Me JA)处理后表达量上升。Ta DOF2在经过IAA、ETH、Me JA和ABA这些激素处理、盐胁迫处理以及MV氧化胁迫处理后表达量都下调。结果显示,Ta DOF1和Ta DOF2呈现出组织特异性,并且可能参与多种调控过程。2.通过提取小麦总RNA以及DNA,克隆到Ta DOF1和Ta DOF2基因以及它们各自的启动子。通过同源序列比对发现了Ta DOF1和Ta DOF2的同源基因,以及Ta DOF2存在于2DL染色体上的等位基因以及两个剪切本。并利用Plant CARE对Ta DOF1和Ta DOF2的启动子元件进行了分析,发现两个基因启动子中含有大量的生物和非生物胁迫及激素响应元件。3.构建了亚细胞定位载体,利用烟草叶片和水稻原生质体的瞬时转化系统对Ta DOF1和Ta DOF2进行了定位分析,发现Ta DOF1和Ta DOF2都定位在细胞核中。4.构建了Ta DOF1、Ta DOF2和Ta DOOF2.2的表达载体,并对三个基因进行了拟南芥和水稻的遗传转化。发现过表达Ta DOF1的水稻矮化,并且分蘖角度增大,而过表达Ta DOF1的拟南芥莲座叶数量变少并且叶片向内卷曲,与此同时,我们还发现过表达Ta DOF1会导致水稻和拟南芥的结实率严重降低。5.构建了Ta DOF1、Ta DOF2以及Ta DOOF2.2的原核表达载体,并对三个基因进行了原核表达分析。筛选出三个可能与Ta DOF1相互作用的下游靶基因,即Ta PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)、Ta IDH(异柠檬酸脱氢酶基因)以及Ta PPDK(丙酮酸磷酸双激酶基因),并克隆了其中的七个基因序列。通过EMSA实验对Ta DOF1和三个基因启动子的结合进行了验证,结果表明,Ta DOF1和Ta PEPC、Ta IDH以及Ta PPDK启动子上的预测位点都可以特异结合。以上结果表明,Ta DOF1和Ta DOF2在小麦中的表达具有一定的组织器官特异性,且其表达受IAA等激素及高盐等非生物胁迫的影响。过表达Ta DOF1降低了水稻和拟南芥的结实率,Ta DOF1可能通过负调控碳代谢途径关键基因,如Ta PEPC、Ta IDH和Ta PPDK的表达而参与植物对氮素的吸收。
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