恶性肿瘤的高发性及其难以治愈性仍是人类健康面临的重大威胁之一。上皮性卵巢癌在女性恶性肿瘤中发病率居第三位,具有不易早期诊断、恶性程度高、易盆腹腔转移、对抗化疗、易产生耐药、治疗效果差等特点,死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。随着对恶性肿瘤发生发展分子机制研究的不断深入,恶性肿瘤的基因治疗和细胞移植免疫治疗已成为当今肿瘤领域的研究热点,但其作为肿瘤治疗新手段在临床应用尚存在一些问题,仍需进一步研究和探索。　　 自从基因治疗出现以来,造血干细胞(HSC)一直被认为是最理想、最有发展前景的载体细胞,也是基因治疗研究中使用时间最长的一种人体干细胞。这源于HSC是一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞,它是体内各种血细胞的唯一来源,主要存在于骨髓、外周血和脐血中。近年,随着HSC分离纯化技术、体外培养技术以及移植技术日趋成熟,为HSC基因治疗提供了技术保证。HSC回输后,无论在骨髓还是外周血中,目的基因表达产物都可以通过血液循环到达靶器官,同时HSC可以分化成各种成熟血细胞,如:淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞和红细胞等,可随血液循环分布于全身,有利于携带的目的基因发挥治疗作用。　　 自1989年Gluckman等首次对1例5岁Fanconi贫血男孩进行了HLA匹配脐血移植治疗获得成功,1994年Kurtzberg等报道了HLA非匹配脐血移植的成功病例以来,脐血移植在HSC移植领域中越来越突显其优势,已经受到了国内外学者的广泛关注。目前,伴随着脐血造缸干细胞(UHSC)移植技术的日益成熟及广泛应用,临床上用UHSC移植治疗的病种不断扩大,现已达80余种。UHSC已经成为最经济而有效的干细胞来源,更为基因治疗的开展,拓宽了一个更广阔的技术平台。　　 2000年Erice研究报道,脐血中除了含有HSC以外,亦含有来自中胚层的间充质干二细胞(MSC)。进一步研究证实,脐血间充质干细胞(UMSC)具有强大的增殖能力,在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能,在特定条件诱导下可以分化为各种组织细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、成肌膜、成肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。研究报道MSC具有极好的迁移能力(excellent migratory ability)和肿瘤趋向性(tropism)。亦有研究显示外源UMSC进入体内后,也会优先聚集于肿瘤组织,而且UMSC体外能大量扩增,被外源基因转染并保持高效、长时间表达,还具有低免疫原性,能在宿主体内长期存留。UMSC的这些特性为肿瘤基因治疗和细胞移植免疫治疗提供了新的策略。　　 IL-21是具有多种生物学功能的重要免疫调节因子,能介导固有性免疫向适应性免疫转换,参与体液免疫和细胞免疫应答。IL-21可促进B、T细胞增殖,促进脐血祖细胞转化为NK细胞,并使其对靶细胞的细胞毒性增加。越来越多的研究已经证实IL-21细胞因子在抗肿瘤治疗中具备强大潜能。因此,我们将IL-21构建于含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒上,将重组体pIESR2-IL-21-EGFP用于基因修饰的治疗性实验中。细胞基因修饰在基因治疗中一直为人们所关注,并逐步成为一种征服多种疾病的重要手段。　　 本研究基于目前对脐血干细胞(USC)基因治疗的最新认识,对USC中的UHSC和UMSC进行体外培养,对它们的生物学特性、分化趋势和定向诱导分化及靶向性等进行研究,并以此为基础进行USC转基因治疗实体肿瘤,尝试将基因治疗与细胞移植免疫治疗相结合抗卵巢痛实体瘤,观察其疗效,探讨其可能的作用机制。　　 目的:将重组体pIESR2-IL-21-EGFP分别转染CD34+UHSC和UMSC,以荷上皮性卵巢癌裸鼠为动物模型,分别移植CD34+UHSC-IL-21和UMSC-IL-21对荷瘤裸鼠进行实验性治疗和观察,再通过体内外的一系列实验,探讨IL-21基因修饰的CD34+UHSC和UMSC治疗卵巢癌的效应及其作用机制。为实现USC基因治疗卵巢癌的临床应用奠定理论基础和提供实验佐证。　　 方法:　　 1.建立稳定的CD34+UHSC的体外分离、培养扩增体系,研究其若干生物学特性,并寻找体外培养的CD34+UHSC进行基因修饰的最佳时期,以提高转染效率,为后续实验奠定基础。　　 2.探讨IL-21转染的CD34+UHSC(CD34+USC-IL-21)对荷卵巢癌裸鼠的治疗作用。将裸鼠分为三组,PBS对照组、CD34+UHSC组及CD34+UHSC-IL-21组,分别观察局部移植CD34+UHSC-IL-21和尾静脉输注CD34+UHSC-IL-21对荷卵巢癌裸鼠的治疗效果,并探讨其可能的作用机制。　　 3.UMSC的体外培养、鉴定及靶向性研究。分析比较从脐血单个核细胞(mononuclearcell,MNC)和从CD34-UHSC细胞巾培养获得UMSC的生长特性,应用FCM检测其表面特征性分子,同时进行成脂、成骨定向诱导分化研究。之后,将UMSC用红色荧光染料PKH26标记,经尾静脉输注及局部移植于荷卵巢痛裸鼠体内,观察经PKH26标记过的UMSC在裸鼠体内的迁移,为建立UMSC靶向治疗研究奠定实验基础。　　 4.探讨IL-21修饰的UMSC对荷卵巢癌裸鼠的治疗作用。将裸鼠分为四组,PBS对照组、UMSC空质粒组(pIRES2-EGFP窄质粒转染UMSC组)、UMSC组和UMSC-IL-21组(pIRES2-IL-21-EGFP转染UMSC组),对其疗效进行观察,并探讨其作用机制。　　 结果:　　 1.体外可获得纯化的CD34+UHSC,生长稳定、增殖能力强,但随体外培养时间的延长,CD34+分子标志逐步丢失,提示即使添加了各种对UHSC具有重要调控作用的细胞因了,仍不能解决UHSC体外长期培养扩增所面临的细胞分化问题,应根据实验目的适时使用。　　 2.pIRES2-IL-21-EGFP可成功转染CD34+UHSC。CD34+UHSC-IL-21能抑制肿瘤生长,延长荷瘤裸鼠生存期,治疗鼠肿瘤局部能表达IL-21、血清IFN-γ和TNF-α水平升高,NK细胞含量、MIC A/B表达及NK细胞杀伤活件明显增强,与其它组相比,差异有明显统计学意义。转染IL-21的CD34+UHSC有良好地抗裸鼠卵巢癌作用,该结果为临床使用CD34+UHSC为载体的基因治疗卵巢癌研究奠定了基础。　　 3.从脐血中成功分离培养获得UMSC,其表面分子CD34、CD133、CD44、CD29及CD90的表达符合UMSC特性,并成功对其进行成脂、成骨定向诱导分化。研究结果显示从CD34-UHSC细胞中获得的UMSC较从MNC中获得的UMSC纯度更高。荧光显微镜观察PKH26标记的UMSC生物学特性与未标记UMSC相比无明显改变。标记UMSC经尾静脉输注给荷卵巢癌裸鼠14天后,在裸鼠脾脏及肿瘤组织中均可见发出红色荧光的标记细胞,脾组织中的红色荧光细胞数多于肿瘤组织,其荧光强度也较强。局部移植标记UMSC的荷瘤裸鼠在移植21天时肿瘤局部仍可观察到红色荧光。利用PKH26标记UMSC可作为体内短期示踪细胞移植治疗疾病的一种有效方法。　　 4.pIRES2-IL-21-EGFP转染的UMSC能表达IL-21和EGFP。UMSC-IL-21治疗组,能抑制肿瘤生长,延长荷瘤裸鼠生存期,与其它组相比,差异有明显统计学意义。UMSC-IL-21组肿瘤局部能表达IL-21与NKG2D、脾细胞分泌IFN-γ能力升高,NK细胞杀伤活性增强。UMSC-IL-21有良好抗裸鼠卵巢癌作用,其机制可能与高表达IL-21诱导IFN-γ分泌增加,激活NK细胞活性有关。其研究结果为卵巢癌的治疗提供了新的策略和方法。　　 结论:本研究结果表明,脐血中至少存在两种干细胞,UHSC和UMSC。其中UMSC具有多向分化潜能和肿瘤趋向性,因此成为基因治疗理想的载体细胞之一。CD34+UHSC-IL-21和UMSC-IL-21在荷卵巢癌裸鼠模型中,具有良好的抗卵巢癌实体瘤作用。该结果为临床使用USC为载体的基因治疗卵巢痛研究奠定了理论及实验基础。