目的宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位,世界上每年的新发病例约为45万,死亡率为50%。其中人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）.与宫颈癌及重度子宫颈上皮内瘤（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）的发生发展密切相关。在对HPV相关肿瘤的免疫监控中,细胞毒性T淋巴细胞发挥了重要的作用。但最近研究发现,种导致T细胞增殖力和活性降低的色氨酸代谢初始限速酶-吲哚胺2,3-二氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）能在肿瘤细胞中表达.这可能是引起肿瘤免疫逃逸的重要因素之一。由于目前对IDO在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌患者免疫系统影响的机制研究还相对较少。因此我们拟通过本课题三部分研究,初步探讨IDO在宫颈癌发生发展中的作用。第一部分探讨IDO在人类宫颈癌和宫颈癌淋巴结组织中的表达特性以及与临床分期、细胞分化、高危型HPV感染之间的相关性,同时了解IDO对机体免疫系统的影响。第二部分将小鼠IDO基因转染至来源于C57BL/6小鼠的肿瘤细胞系TC-1细胞,了解IDO表达阳性肿瘤细胞的生物学特性、对T淋巴细胞的影响及其机制。第三部分采用IDO基因转染的TC-1细胞建立C57BL/6小鼠宫颈癌IDO过表达模型,了解IDO在活体内的特性以及对T细胞的影响。从整体、细胞及分子水平探讨IDO参与宫颈癌免疫逃逸的部分机理,为探索消除肿瘤免疫逃逸方法提供理论依据。方法：第一部分临床试验1临床研究第一部分：吲哚胺2,3-二氧酶在CINI-III及宫颈癌组织中的表达及其与HR-HPV感染的相关性研究选择2007年4月-2008年4月在昆明医学院第三附属医院符合纳入标准,病理确诊为CINI-III和宫颈癌的组织石蜡标本116例及宫颈癌转移淋巴结石蜡标本18例。以正常宫颈组织石蜡标本20例及宫颈癌无转移淋巴结组织石蜡标本20例作为对照,采用免疫组化方法分析组织中IDO的表达,进一步分析宫颈组织IDO表达与高危型HPV感染之间的相关性。2临床研究第二部分宫颈癌组织中IDO表达与外周血中CD3⁺T细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Tregs的相关性研究选择2008年6月-2008年10月期间在昆明医学院第三附属医院符合纳入及排除标准的CINIⅡ患者20例；宫颈癌患者20例；正常宫颈20例。按病理诊断分为三组：正常宫颈组（20例）；CINIⅡ组（20例）；宫颈癌组（20例）。阴道镜下取宫颈组织,抽空腹静脉血1ml。采用流式细胞仪检测静脉血中CD3+T细胞数量、CD4⁺T细胞数量、CD8⁺T数量细胞、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Tregs数量及CD4+/CD8+。半定量RT-PCR和western blot检测各组宫颈组织中IDOmRNA和蛋白表达。进一步分析各组宫颈组织中IDO表达与外周血中CD3+T细胞数量、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Tregs数量及CD4⁺/CD8⁺之间的相关性。第二部分细胞生物学实验：IDO表达阳性TC-1细胞生物学特性及其对T细胞影响的研究1.构建重组IDO/pcDNA3.1/Zeo表达载体200u/ml小鼠重组干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）诱导培养2×10⁶RAW264.7细胞24小时,使RAW264.7表达IDOmRNA。采用RT-PCR方法获得目的基因。PCR产物及pcDNA3.1/Zeo载体经HindⅢ和BamH双酶切、凝胶回收后将目的基因与pcDNA3.1/Zeo载体连接得到重组表达载体IDO/pcDNA3.1/Zeo。2获得IDO/pcDNA3.1/Zeo稳定转染TC-1细胞采用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1/Zeo、IDO/pcDNA3.1/Zeo转染至TC-1细胞,400u/ml zeocin筛选获得稳定转染阳性细胞克隆。3细胞生物学实验3.1 RT-PCR和western blot方法检测IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞中IDOmRNA和蛋白表达。3.2 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）法检测细胞增殖每孔取100ul浓度为5×10³/ml TC-1细胞、转染pcDNA3.1/Zeo质粒Tc-1细胞、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞种植于96孔板,分别于培养24、48、96、120、168、216小时MTT法检测各组细胞增殖情况。3．3细胞侵袭实验检测细胞侵袭力5x10⁵cells/ml TC-1细胞、转染空载体细胞Tc-1细胞、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞各300μl种植于24孔侵袭小室上室matrigel上,37℃,5% CO2细胞培养箱内孵育24小时后观察侵袭细胞数。3.4高效液相法检测细胞培养液中色氨酸及犬尿素浓度RPMI-1640培养基、5×10⁴/mlTC-1细胞+RPMI-1640培养基、转染pcDNA3.1/Zeo质粒细胞TC-1+RPMI-1640培养基、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞+RPMI-1640培养基各300μl植于96孔板,37℃,5%C02细胞培养箱内孵育24小时后高效液相法检测各组细胞培养液中色氨酸及犬尿素浓度。3.5羧基荧光素二醋酸盐酸琥珀酰亚胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE）标记淋巴细胞增殖实验将600μl/孔,密度为1×10⁶/ml的空白对照组（CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞）,实验对照（CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10μg/ml）、TC-1细胞组（CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10μg/ml+TC-1细胞）、转染pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组（CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10ug/ml+转染pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞）、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组（CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10ug/ml+转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞）种植于24孔板,37℃,5%C02细胞培养箱内共培养24小时、48小时、72小时,流式细胞仪检测各组CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和CFSE荧光强度。3.6混合淋巴细胞培养CD4+CD25+Foxp3+Tregs增殖实验600ul/孔,密度为1×10⁶/ml空白对照组（小鼠脾淋巴细胞）,实验对照（小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10μg/ml）、TC-1细胞组小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10μg/ml+TC-1细胞)、转染pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组（小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10ug/ml+转染pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞）、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组（小鼠脾淋巴细胞+刀豆蛋白10ug/ml+转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞）种植于24孔板,37℃,5%C02细胞培养箱内共培养24小时,流式细胞仪检测各组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞数量3.7 T淋巴细胞细胞毒性检验将磁珠分离得到的小鼠脾脏肿瘤特异性CD8+T细胞作为效应细胞,TC-1细胞、转染pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞分别作为靶细胞,500个细胞／孔靶细胞,效靶比25:1,10:1,5:1加含15%胎牛血清的RPMI1640培养液共100μl接种于96孔板中Experimental区域,同时设立效应细胞自然释放组、靶细胞自然释放组和靶细胞最大释放组、体积对照组、培养基对照组37℃,5%CO₂培养箱孵育4h。检测培养液490或492nm吸光度。第三部分动物实验：小鼠宫颈癌IDO过表达对肿瘤生长及免疫系统影响的研究以雌性,4-6周龄,体重18-22g,近交系C57BL/6小鼠40只建立小鼠宫颈癌模型和小鼠宫颈癌IDO过表达模型。将小鼠随机分为4组,每组10只：空白对照组（单纯注射生理盐水）、TC-1组（注射TC-1细胞）、pcDNA3.1/Zeo.转染TC-1细胞组（注射pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞）、IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组（注射重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞）。每天观察体重,每三天测量肿瘤体积。待肿瘤生长至最大径线为1.0-1.5cm时小鼠眼眶取血后断颈处死,取出肿瘤称重,免疫组化染色观察肿瘤组织中IDO表达阳性细胞分布、半定量RT-PCR和western blot检测肿瘤组织中IDOmRNA和蛋白表达,取出小鼠脾脏分离淋巴细胞进行淋巴细胞杀伤实验,流式细胞仪检测眼眶血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞和CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量。结果第一部分临床研究临床研究第一部分：吲哚胺2,3-二氧酶在CINI-Ⅲ及宫颈癌组织中的表达及其与HR-HPV感染的相关性研究正常宫颈（20例）及CINI组织（10例）中IDO表达均为阴性,20%（2/10）的CINIⅠ组织表达为弱阳性,其余为阴性（80%,8/10）,CINIⅡ中有61.5%（8/13）的组织呈弱阳性表达,7.7%（1/13）的组织为阳性表达,30.8%（4/13）的组织为阴性表达,宫颈癌Ⅰ—Ⅳ期的阳性表达率为100%（83／83）,ⅠA期和ⅠB期阳性表达率显著高于CINIⅠ和CINIⅡ（P<0.01）,ⅡA期-ⅣB期阳性表达率显著高于ⅠA期和ⅠB期（P<0.01）。IDO表达与宫颈癌进展有关（OR=0.807,P<0.01）。淋巴结转移组织中IDO阳性表达率显著高于淋巴结转移阴性组织（P<0.01）,IDO阳性表达率与肿瘤分化程度无关（OR=-0.139,P>0.05）。20例正常宫颈中均未检出高危型HPV。CINI中有20%（2例/10例）、CINIⅠ中50%（5例/10例）、CINIⅡ中92.3%（12例/13例）,宫颈癌95.2%（79/83）可检测到高危型HPV。CINIⅠ-CINIⅡ、宫颈癌高危型HPV检出率显著高于正常宫颈和CINI（P<0.001）,宫颈癌高危型HPV检出率显著高于CINⅡ～CINⅢ（P=0.007）。高危型HPV感染阳性的患者宫颈组织中IDO阳性表达率显著高于高危型HPV感染阴性患者（X²=45.261,P<0.001）,高危型HPV感染与IDO表达有相关性（τb=0.577,P<0.001）。临床研究第二部分：宫颈癌组织中IDO表达与外周血中CD4+T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs的相关性研究肿瘤组织半定量RT-PCR和Western blot结果显示：宫颈癌IDOmRNA和蛋白表达均高于CINIⅡ（P<0.001,P<0.001）和正常宫颈组织（P<0.001,P<0.001）,而宫颈原位癌高于正常宫颈组织（P<0.001,P<0.001）,差异有统计学意义。流式细胞检测显示宫颈癌患者外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞数量及CD4⁺/CD8⁺显著低于正常宫颈组（P<0.001,P<0.001,P=0.005,P<0.001）和CINIⅡ组（P<0,001,P<0.001,P=0.026,P<0.001）。但在正常宫颈组和CINIⅡ组无显著性差异（P=0.288,P=0.658,P=0.524,P=0.964）。宫颈癌组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs数量显著高于正常宫颈组（P<0.001）和CINIⅡ组（P<0.001）,在正常宫颈组和CINIⅡ组差异无统计学意义（P=0.087）。正常宫颈IDOmRNA表达及蛋白表达与CD3+T细胞（r=-0.537,P=0.015；r=-0.455,P=0.044）,CD4+/CD8+T细胞（r=-0.654,P=0.002,r=-0.684,P=0.001）呈负相关；与CD⁴+CD25⁺Foxp3⁺Tregs （r=0.487, P=0.029, r=0.514,p=0.020）呈正相关。宫颈CINIⅡ组IDO mRNA表达及蛋白表达与CD3+T细胞（r=-0.783,P<0.001；r=-0.768,P<0.001）,CD4⁺/CD8⁺T细胞（r=-0.778,P<0.001,r=-0.771,P<0.001）呈负相关；与CD4⁺CD25⁺Foxp3+Tregs（r=0.841,P<0.001,r=0.850,P<0.001）呈正相关。宫颈癌组IDO mRNA表达及蛋白表达与CD3+T细胞（r=-0.881,P<0.001；r=-0.919,P<0.001）,CD4⁺/CD8⁺（r=-0.870,P<0.001,r=-0.733,P<0.001）呈负相关；与CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺Tregs（r=0.885,P<0.001,r=0.824,P<0.001）呈正相关。第二部分细胞生物学1 IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒重组表达载体鉴定IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒经酶切鉴定及序列测定显示IDO基因成功连接到载体pcDNA3.1/Zeo质粒上。2 RT-PCR和Western blot检测重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒转染TC-1细胞IDOmRNA和IDO蛋白表达重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞经RT-PCR凝胶电泳和蛋白电泳显在233bp处可见IDOcDNA条带,在45Kd处可见IDO蛋白条带。而TC-1细胞和转染空载体的TC-1细胞未见目的条带。3重组IDO/pcDNA3.1/Zeo+质粒转染TC-1细胞增殖活性TC-1细胞、转染空载体TC-1细胞、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞在24小时（F=0.47,P>0.05）、48小时（F=3.064,P>0.05）、96小时（F=1.55,P>0.05）、120小时（F=0.744,P>0.05）、216小时（F=0.110,P>0.05）的生长增殖无显著性差异。4重组IDO/pcDNA3.1/Zeo+质粒转染TC-1细胞侵袭力转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞侵袭数为29.688±5.437个／高倍镜,560nmOD值为0.979±0.024,转染空载体TC-1细胞侵袭数为16.688±2.024个／高倍镜,560nmOD值为0.745±0.127,TC-1细胞侵袭数为18.875±3.845个／高倍镜,560nmOD值为0.727±0.045。转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞的侵袭细胞数／高倍镜和OD值显著高于转染空载体TC-1细胞（P<0.001,P<0.01）和TC-1细胞（P<0.001,P<0.01）。转染空载体TC-1细胞和TC-1细胞之间无显著差异（P>0.05,P>0.05）。5细胞培养上清液中色氨酸及代谢产物浓度转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组培养上清液中色氨酸浓度显著低于RPMI-1640培养基（P<0.001）、TC-1细胞组（P<0.001）、转染空载体TC-1细胞组（P<0.001）。转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组犬尿素浓度显著高于培养基P<0.001、TC-1细胞组（P<0.001）、转染空载体TC-1细胞组（P<0.001）。色氨酸浓度及犬尿素浓度在TC-1细胞组和转染空载体TC-1细胞组之间无显著差异,（P=0.949,P=0.803）。6 CFSE标记的混合淋巴细胞培养实验检测CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞增殖活性将TC-1细胞、转染空载体TC-1细胞、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞与CFSE染色的脾淋巴细胞共培养24-72小时,空白对照组、对照组及TC-1细胞组、转染空载体TC-1细胞组的同期CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞数均显著高于转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组,差异有统计学意义（P<0.01）。对照组、TC-1细胞组、转染空载体TC-1细胞组的CD4⁺T、CD8⁺T细胞数细胞数高于同期空白对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。CFSE染色显示空白组共培养72小时后,CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞增殖均为2-3代,转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组共培养72小时的CD4+T细胞显示增殖1-2代,CD8⁺T细胞在2孔样本中CFSE荧光强度和共培养前CFSE荧光染色强度相似,1孔显示增殖1代。对照组、TC-1细胞组、转染空载体TC-1细胞组CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞显示增殖至少为4代7混合淋巴细胞培养检测CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs数量流式细胞仪检测显示混合淋巴细胞共培养24小时转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞组CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量显著高于空白组（P<0.01）、对照组（P<0.01）、TC-1细胞组（P<0.01）、转染空载体TC-1细胞组（P<0.01）。CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量在空白组、对照组、TC-1细胞组、转染空载体TC-1细胞组之间差异无统计学意义（P>0.05）。8 T淋巴细胞细胞毒性检验采用流式细胞仪检测磁珠分离荷瘤小鼠脾脏CD8⁺T细胞分选纯度达91.5%。将CD8⁺T细胞与TC-1细胞、转染空载体TC-1细胞组、转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞共同孵育4小时检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用结果显示,CD8⁺T细胞与TC-1细胞、转染空载体TC-1细胞组在最佳效靶比10∶1时的杀伤效率能达到18.189±0.514%,18.879±0.397%。而对转染重组IDO/pcDNA3.1/Zeo质粒TC-1细胞最佳效靶比10∶1时的杀伤效率仅达到9.412±0.398%,差异有统计学意义（P<0.01,P<0.01）。第三部分动物实验1小鼠一般状况90%（9/10）TC-1细胞组小鼠,80%（8/10）pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组小鼠和100%（10/10）重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组小鼠在接种肿瘤细胞后第4天腋下出现肿瘤,注射生理盐水的对照组无肿瘤生长。重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组自肿瘤出现后第6天肿瘤体积显著大于TC-1细胞组和pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组,差异有统计学意义（P<0.01）；体重较对照组、TC-1细胞组和pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组明显减轻,差异有统计学意义（P<0.01）。重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组肿瘤重量显著大于TC-1细胞组和（P<0.001）,pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组（P<0.001）。2免疫组化检测肿瘤组织IDO表达免疫组化染色结果显示肿瘤组织IDO无阴性表达,重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组IDO表达阳性率较pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组（t=5.7266，P<0.001）和TC-1细胞组（t=2.6337,P<0.05）高,差异有统计学意义。TC-1细胞组与pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组IDO表达无显著性差异（t=0.5074,P>0.05）。3小鼠外周血CD3⁺T细胞,CD4⁺T细胞,CD8⁺T细胞、CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量变化与空白组比较,小鼠TC-1细胞组、pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组、重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组CD3⁺T细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞数量及CD4⁺/CD8⁺显著降低,P<0.05,P<0.01,P<0.001),而CD4+CD25+Foxp3+Tregs则显著增加,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。TC-1细胞组、pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组之间CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞、CD4+/CD8⁺ CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量无显著差异（P>0.05）。重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞数量及CD4+/CD8+较其他各组显著下降、CD4+CD25+Foxp3+Tregs较其他各组显著增加,差异有统计学意义（P<0.001）。4半定量RT-PCR和western Blot检测肿瘤组织中IDOmRNA和蛋白表达IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组IDOmRNA和蛋白表达均高于TC-1细胞组（P<0.001,P<0.001）和pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组（P<0.001,P<0.001）。TC-1细胞组和pcDNA3.1/Zeo空载体转染TC-1细胞组之间差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。5 IDO表达与外周血CD3⁺T细胞、CD4+T细胞/CD8⁺T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs数量相关性重组IDO/pcDNA3.1/Zeo转染TC-1细胞组IDO mRNA表达及蛋白表达与CD3+T细胞（r=-0.851,P=0.002；r=-0.792,P=0.006）,CD4+/CD8+（r=-0.809,P=0.005,r=-0.806,P=0.005）呈负相关；与CD4+CD25+Foxp3+Tregs（r=0.886,P=0.001,r=0.872,P=0.001）呈正相关。结论1 IDO在宫颈癌中有高表达与宫颈癌有密切关系。2 IDO在宫颈癌中的表达临床分期、HR-HPV感染有关,与肿瘤分化程度无关。3宫颈癌淋巴结转移与IDO表达有关。4表达IDO的宫颈癌细胞可抑制T淋巴细胞的增殖活性和免疫杀伤功能,可能与色氨酸代谢有关。5刀豆蛋白不能诱导CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs增殖,而IDO可能是其增殖的有效刺激物。6宫颈癌细胞通过表达IDO可诱导CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs活化,可能是肿瘤免疫逃逸因素之一。7 IDO可增强肿瘤细胞的侵袭性但不影响肿瘤细胞增殖活性。