论文部分内容阅读
动脉粥样硬化是一种极具社会危害性的慢性疾病,主要表现为脂质在内皮下的沉积,炎性细胞浸润及新内膜形成。动脉粥样硬化的发病率和致死率都非常高,已成为全球第一致死病因。目前,关于动脉粥样硬化的发病机制众说纷纭,其中最公认的是“血管内皮细胞损伤反应学说”及由其发展而来的“炎性理论”。内皮功能损伤导致内皮通透性增加,循环中的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein,LDL）进入内皮活化血管内皮细胞。活化的内皮细胞产生多种粘附分子,诱导单核细胞的粘附和浸润。单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子的诱导下分化成巨噬细胞。巨噬细胞分泌的各种促炎性因子和生长因子刺激中膜内血管平滑肌细胞的增殖和爬行,形成新内膜。巨噬细胞连同新内膜中的血管平滑肌细胞进一步大量摄入脂质变成泡沫细胞,形成粥样斑块。肌浆网/内质网钙ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA）是细胞内调控钙的关键酶,主要作用是将细胞浆内的钙离子(Ca2+)摄入到肌浆网和内质网（endoplasmic reticulum,ER）,对维持细胞内Ca2+稳态和ER稳态至关重要。左心室肥大、心衰和动脉粥样硬化等心血管疾病中,SERCA的活性或表达明显下调。SERCA2是SERCA在血管系统的主要亚型,其674位的半胱氨酸（C674）是主要的氧化还原位点,调控SERCA2的功能。C674是受血管舒张因子一氧化氮调控的关键谷胱甘肽化位点,增加SERCA2的活性进而舒张血管;引起活性氧/氮自由基大量增加的病理情况都可以造成C674的不可逆性氧化,导致SERCA2失活及ER Ca2+重吸收障碍,参与了心血管疾病的进程。在人的动脉粥样硬化样本中,C674的不可逆氧化明显增加。关于SERCA2及病理情况下C674的不可逆氧化与动脉粥样硬化的关系尚不清楚。我们将C674突变成丝氨酸（C674→S674）来模拟C674位点的不可逆性氧化对这一位点谷胱甘肽化的抑制,在SERCA2启动子的调控下构建了C674S基因突变敲入鼠（SERCA2C674S knock-in mouse,SKI）。我们的前期研究表明,纯合子SKI死于血管发育的关键时期。杂合子SKI（以下简称SKI）下肢缺血后血流恢复缓慢,表明C674失活与病理性血管生成障碍相关,其中内皮细胞的功能障碍部分参与了阻碍新血管的生成。因为内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因素,推测病理情况下内皮细胞的C674不可逆氧化直接参与了动脉粥样硬化的进程。本研究拟从内皮细胞角度探讨SERCA2 C674的失活与动脉粥样硬化的关系及其相关调控机制,为动脉粥样硬化临床防治提供新的理论依据和干预靶点,具有较好的理论价值和临床意义。材料和方法:为了探讨SERCA2 C674的失活与动脉粥样硬化的关系及其相关调控机制,我们将SKI转入到动脉粥样硬化易感的低密度脂蛋白受体基因缺陷（low density lipoprotein receptor deficient,LDLR-/-）遗传背景,并饲喂高脂饮食来加速动脉粥样硬化的进程。在培养的小鼠冠状动脉内皮细胞,分析功能及内质网应激相关蛋白及炎性因子的表达水平。SERCA2b是血管中SERCA2的主要基因型。与缺陷性腺病毒空载体（Adv）对照相比,分析过表达缺陷性腺病毒SERCA2b C674S对内质网应激相关蛋白和炎性因子的影响。结果:（1）与对照LDLR-/-小鼠相比,SKI/LDLR-/-小鼠的体重及血清中胆固醇和甘油三酯的含量没有明显差别,但它们主动脉弓和主动脉根部的脂质沉积明显增加,表明SERCA2 C674的失活加速动脉粥样硬化的进程。（2）在分离培养的小鼠冠状动脉内皮细胞,与来自对照野生型小鼠（wild type,WT）的内皮细胞相比,在来自SKI的内皮细胞:1)内质网应激蛋白p-eIF2α和CHOP的表达明显增加,而ERO1α表达降低,表明内皮细胞中C674的失活诱导内质网应激;2)炎性因子VCAM1及调控炎性因子表达的Cav-1表达均增加,并且巨噬细胞对内皮细胞的粘附增加;3)自噬相关蛋白LC3的表达明显增加。（3）在分离培养的WT冠状动脉内皮细胞,与过表达Adv对照相比,过表达SERCA2b C674S:1)明显增加内质网应激蛋白BiP、ATF6、CHOP以及介导了内质网应激的LOX-1的表达水平,降低ERO1α的表达水平;2)明显增加VCAM1和ICAM1等炎性因子和粘附分子的表达水平,增加趋化因子MCP-1的表达水平,并上调炎性相关因子TNF-α、IL-6的表达水平;3)上调调控血管重构建的OPN、MMP2的表达水平并减少MMP抑制酶TIMP-1的表达水平;4)上调Cav-1的表达水平,并下调抗炎因子PPARγ的表达水平,表明SERCA2b C674的失活促进了内皮细胞的炎性反应;5)上调自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达水平。结论:病理情况下SERCA2 C674的不可逆氧化加速动脉粥样硬化的进程。在内皮细胞中,SERCA2 C674的部分失活诱导内质网应激,导致内皮细胞的活化,促进巨噬细胞对内皮细胞的粘附和浸润。在内皮细胞中,过表达SERCA2b C674S诱导内质网应激,增加炎性因子及细胞凋亡相关蛋白的表达。我们推测,病理情况下SERCA2 C674的不可逆氧化导致的ER Ca2+库减少引起内质网应激,诱导内皮细胞炎性反应及凋亡,从而加速动脉粥样硬化的进程。