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背景:通过及时的再灌注干预手段治疗急性心肌梗死(AMI)很大程度上提高了冠心病患者的生存预后。但是,仅开通心外膜血管,有时并不能改善病人的真正预后。因此,该研究将聚焦于心脏的再灌注损伤的机制研究和药物干预手段。微循环是心脏血供的最末端,是感应缺血缺氧最敏感的部分,因此微循环的内皮细胞和心肌细胞是作为该研究的重点。我们前期研究提示细胞内钙超载和过量活性氧生成是造成一系列损伤的启动因素。SERCA2a作为最重要的内质网上钙回收蛋白被广泛进行研究。前期研究证实在IR条件下,SERCA2a活性降低,导致细胞内超载损伤。其他研究有提示SERCA2a的转录后修饰是其活性降低的主要因素。因此我们首先将聚焦于心脏缺血再灌注(IR)条件下SERCA2a的转录后修饰作用。因此,更深一步研究将聚焦于SERCA2a诱导的细胞钙超载,是否与线粒体损伤性分裂,以及线粒体钙超载导致的线粒体凋亡程序启动有直接相关性。除此以外,该团队前期研究发现,褪黑素对微循环缺血再灌注损伤有保护作用,因此针对线粒体的研究,我们力求完善褪黑素保护IR损伤后的线粒体结构功能的机制研究。目的:本研究旨在阐明心肌缺血再灌注介导微循环损伤的分子机制,探究SERCA2a转录后修饰作用对胞质钙平衡的作用,明确SERCA2a作为上游信号分子对线粒体分裂和钙依赖的细胞运动的影响,在此基础上,探究褪黑素保护线粒体完整性的新的作用靶点。方法:体内实验部分利用WT小鼠、SERCA2a过表达小鼠(SERCA2aAVV)以及OPA-1心脏特异性敲除小鼠OPA-1CKO,建立心肌再灌注损伤模型。体外实验分为两部分,第一部分从乳鼠心脏中分离并提取心肌微循环内皮细胞(CMEC),第二部分从小鼠心脏中分离心肌细胞,同时建立细胞水平缺氧复氧损伤模型。首先体内实验部分,利用WB、免疫共沉淀、免疫组化、HE染色、免疫荧光、线粒体电镜、小动物超声、TUNEL染色、Evans Blue染色等方法,观察了心脏不同蛋白表达水平差异、微循环数量、心梗面积、心脏活性氧水平、线粒体形态、心脏功能、心肌凋亡比例以及管腔结构和炎症细胞渗透情况;细胞水平,利用流式细胞学、免疫荧光、WB、细胞迁移、Transwell、管腔形成实验、免疫共沉淀、DCFHDA探针技术、JC-1染色、细胞TUNEL染色、电镜等技术,观察细胞在不同模型条件下,钙水平的变化、活性氧水平的变化、蛋白表达差异、内皮细胞运动能力、以及线粒体膜电位、膜孔道开发情况、细胞凋亡比例等。结果:1.微血管IR损伤会导致SERCA2a的翻译后修饰和该蛋白随后的降解作用。2.重新过表达SERCA2a会减少心脏梗塞大小,恢复心脏收缩功能,维持微血管完整性和随后的炎症分布。3.体外机制探究提示SERCA2a功能障碍引起胞质Ca2+超载和内质网应激,过表达SERCA2a能有效减轻损伤。4.SERCA2a功能障碍不仅引发内质网应激,还引起胞质Ca2+超载诱导的Ca2+/钙调磷酸酶-SSHlL-cofilin信号级联的去磷酸化和活化作用。5.活化的cofilin增加F-肌动蛋白解聚降低了 IR损伤后的新生血管生成。6.活化的cofilin诱导F-肌动蛋白解聚并转位到线粒体的外膜上,参与Drpl介导的病理性线粒体分裂。7.我们的结果证实OPA1相关的线粒体融合/线粒体自噬,在心脏I/R损伤条件下由褪黑激素调节。8.通过褪黑激素作用下的AMPK-OPA1-线粒体融合/线粒体自噬可能是一种减少心脏I/R损伤的新型药物治疗和干预的方法。结论:1.微循环IR损伤导致SERCA2a转录后修饰、活性降低以及表达量减少,最终导致了细胞内的钙超载损伤;过表达SERCA2a可缓解上述病理过程。2.SERCA2a失活介导了 Ca2+/钙调磷酸酶-SSH1L-cofilin级联信号的去磷酸化和活化,导致微血管内皮细胞运动障碍,病理性线粒体分裂增加,最终导致细胞凋亡增加。3.褪黑素通过促进AMPK-OPA1-线粒体融合作用,维持心肌细胞线粒体的正常数量和稳态。