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研究背景:年龄是冠心病的主要危险因素之一,目前人口老龄化的形式严峻,冠心病是威胁老龄人口健康的主要疾病。内皮细胞的氧化应激损伤是冠心病患者的主要发病机制,随着年龄的增长,内皮细胞发生衰老,衰老的内皮细胞抗氧化应激的能力减弱,导致氧化应激损伤,最终导致动脉硬化、急性心肌梗死及心衰的发生,因此活性氧(Reactive oxygen species,ROS)成为冠心病患者的关键调控因子。ROS是细胞内外信号传导的重要的调控因子,在正常条件下,ROS对生理活动是有益的,多余的ROS可以被对应的抗氧化防御系统所清除,这使得体内ROS的产生及清除处于稳态,在病理条件下,ROS的产生过多,超过了机体的清除能力,导致ROS在体内蓄积,进而导致细胞损伤,这种情况称为氧化应激损伤。衰老内皮细胞结构及功能会发生改变,这是其易受氧化应激损伤的病理基础。线粒体是ROS产生的主要来源,调控细胞的生存及氧化应激,这使得线粒体成为抗氧化应激治疗的靶点。各种外源的线粒体相关药物,目前均处于临床测试阶段,结果中性,且并非冠心病患者治疗的靶点,一直没有被用于临床。增强内源性衰老相关的抗氧化剂成为目前防治冠心病的有效策略。因此,寻找内源性衰老相关的抗氧化应激的靶点似乎是当前研究的重点。人源蛋白(Humanin,HN)是线粒体DNA编码的内源性活性肽,有研究发现人源蛋白的过度表达可以延长蠕虫的寿命,且可保护内皮细胞免受糖脂代谢异常诱导的氧化应激损伤,降低ROS的生成,因此,人源蛋白可能成为治疗冠心病的新靶点。但目前缺乏人源蛋白与冠脉病变程度相关性的人群研究,且氧化应激下,人源蛋白对衰老的血管内皮细胞的具体保护机制还未可知。目的:通过冠心病人群及原代人脐静脉内皮细胞,探究(1)临床意义:人源蛋白是否对冠心病患者有保护作用及人源蛋白与年龄、氧化应激的相关性。(2)分子机制:人源蛋白是否可抑制血管内皮细胞发生衰老及其保护衰老内皮细胞免受氧化应激损伤的具体信号通路。方法与结果:入选2016年1月至2016年12月因急性胸痛就诊于吉林大学第一医院行冠脉造影检查的患者(327人),根据临床资料及冠脉造影结果,将入选患者分为正常组、心绞痛组及急性心肌梗死组。在初次入院时测量血清人源蛋白和硫代巴比妥酸反应物质(Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)的水平。收集所有患者的住院资料及主要心血管事件(Major Cardiovascular Events,MACE)。结果发现,人源蛋白与年龄(r~2=0.039,p<0.001)、氧化应激水平(r~2=0.096,p<0.001)及WBC(r~2=0.049,p=0.001)呈负相关。心绞痛组患者外周血中的人源蛋白水平明显低于正常组(124.22±63.02 vs.157.77±99.93pg/ml,p<0.05),人源蛋白在急性心肌梗死患者的外周血中水平更低(67.17±24.35 pg/ml,p<0.05 vs.正常组)。急性心肌梗死患者的氧化应激标记物TBARS的水平明显高于正常组和心绞痛组(12.94±4.55 vs.8.26±1.66vs.9.06±2.47umol/ml,p<0.05)。人源蛋白是急性心肌梗死发生的独立危险因素,且可用于预测心绞痛患者MACE事件的发生。从产科获取新生儿脐带,从新鲜的脐带中提取人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECS),建立复制性衰老模型及衰老内皮细胞的氧化应激损伤模型。应用HUVECS的第3代(年轻组)及第11代(衰老组)建立复制性衰老模型;应用H2O2(600μM)构建衰老组细胞的氧化应激损伤模型。所提取的HUVECS的纯度应用流式细胞检测技术,细胞活力检测应用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8),衰老程度检测应用β-半乳糖苷酶染色,应用Western blot及QPCR检测两组细胞的人源蛋白、AMPK、P53及铁死亡(Ferroptosis)相关分子的蛋白及m RNA表达水平。结果发现,衰老组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性的百分比明显高于年轻组,且衰老组细胞内人源蛋白、FTH1及COX2的蛋白水平明显高于年轻组。应用不同浓度的人源蛋白类似物(Humanin analogues,HNG)(0.625m M、1.25m M、2.5m M、5m M、10m M)培养衰老组的细胞72小时,结果显示,与对照组相比,HNG可减轻细胞的衰老程度,在HNG 2.5m M的浓度下,内源性人源蛋白水平上调,COX2蛋白水平下降,GPX4水平升高,铁死亡被抑制,HNG发挥最大的抗衰老作用。在衰老细胞的氧化应激损伤模型中,应用HNG(1.25m M,1小时)预处理可提高细胞活力,减轻细胞的氧化应激损伤;HNG预处理后可上调衰老细胞内AMPK、GPX4的蛋白及m RNA水平,下调FTH1、COX2及P53的蛋白及m RNA水平。而抑制AMPK,可抑制氧化应激条件下HNG对铁死亡的调控作用及其对衰老内皮细胞的保护作用。结论:(1)人源蛋白在冠心病患者的外周血中水平下降,是冠心病患者MACE事件的预测因子,人源蛋白与冠脉病变程度相关,其对冠心病患者的保护作用可能与内皮细胞的衰老及氧化应激损伤有关;(2)人源蛋白可通过抑制铁死亡抑制血管内皮细胞发生衰老;且可通过激活AMPK/P53/Ferroptosis信号通路保护衰老的血管内皮细胞免受氧化应激损伤。