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伪狂犬病（Pseudorabies）又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科（Herpesviridae）α亚科中的猪疱疹病毒I（suidherpesvirus Ⅰ）所引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒（除猪外）、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。猪是该病的主要贮存宿主和传染源，对养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟和口蹄疫。灭活苗和弱毒苗的使用对防制本病起到了一定的作用，但存在一些缺点。随着分子生物学技术的发展，已先后有多株基因缺失苗问世，并在该病的预防免疫及根除中起到决定性作用。欧、美一些发达国家已明确规定：只能使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗对猪进行伪狂犬病预防免疫。有许多国家利用该方法及相应监测方法根除了本病。 伪狂犬病病毒上海株（PRV-SH）是从上海地区某猪场发病猪中分离的一株地方毒株，它在PK15细胞上形成的蚀斑小而不规则，TCID50为10-6.68／0.1ml，接种家兔和哺乳仔猪后均出现典型的伪狂犬病症状，与强毒株Ea株具有相似的特性，据此推测，PRV-SH株为强毒株。经过对PRV-SH株gE和gI基因序列分析发现，PRV-SH株gE基因和gI基因与我国的地方分离株Ea株和Fa株的基因同源性及推导的氨基酸同源性都很高，所以选择PRV-SH株为亲本毒株来构建基因缺失疫苗，在我国具有一定的实用价值。 gE基因是PRV的一个重要的毒力基因，在PRV向神经系统的扩散中起重要作用。研究发现，只要缺失掉gE 5’端第125位的缬氨酸和第126位的半胱氨酸，PRV毒力就会大大降低且不影响其免疫原性。gI基因也是决定PRV毒力的一个参考基因，它与gE基因以非共价键的形式结合成gE／gI复合体而发挥功能。完全缺失gE、gI的弱毒株免疫的猪，不能抵抗对强毒的攻击，且gI是诱导完全保护所必须的。gE糖蛋白的N端33位到100位的氨基酸区段包含了主要抗原表位，缺失掉该段基因，在机体内就不能产生相应的抗体，这为区别野毒感染和疫苗接种提供了依据。 绿色荧光蛋白（GFP）是来源于水母体内的一种蛋白，大小为238个氨基酸。后来经过基因突变改造为EGFP，其荧光强度比野生的GFP强45倍。它是用于各种生物体及细胞系的一种理想的生物标记蛋白。它具有检测方便，荧光稳定及对生活的细胞无毒害等优点。 姜颖：伪狂大刑＆毒卜海株gE／gi”／GFP“／LacZ＋缺失株的构建及其免疫原仲初步研究 本研究用 PCR方法扩增了伪狂犬病病毒上海分离株的 gE基困和部分 gi基困，然后用酶切方法缺失掉 gE基因 5’端的毒力部分，保留了部分 gi基因和部分的 gE基因，并在此位置插入了GFP和lacZ两种筛选基因，构建了PRV｛H株的缺失转移载体ggEI《FPZ。用D叮外转染后，首先用蓝斑对重组病毒进行筛选，然后用肝 进一步筛选，获得了重组病毒。通过对小鼠和家兔接种试验，结果表明构建的重组病毒的毒力比亲本毒PRV亿 的毒力有所下降，重组病毒在RK细胞上生长良好，接种断奶仔猪后，无不良反应。现将主要的研究内容概述如下： 根据已发表的伪狂犬病病毒gE和J基困的序列，利用primer软件设计了两对引物，用PCR方法扩增了伪狂犬病病毒上海分离株的gE和J基因，并将其克隆到pGEMT－Easy载体中。通过测序，PRV－SH的gE和旷基因大小分别为二734b和961hp。gE基因与发表的PRV斗a株，Rice株Ea株的同源性分别为97．5％、98．6％、97．9％，推断的氨基酸的同源性为94．6儿97．l人95．7人PRV七H株的gi基因与叩VAice株、PRV－Fa株sl基困核旮酸的同源性分别为94．7％和95．8％；推导的氨基酸的同源性分别为91．3％和92％。这进一步证实了所扩增的基因就是PRV－洲的昨和gi基因。通过分析发现，gE和钉糖蛋白属于典型的 1型膜蛋白结构，且J糖蛋白具有很强的抗原性。 在伪狂犬病病毒上海株J基因和gE基因克隆鉴定的基础上，将gi和gE基因克隆入PUC18中，构建了PPEI载体。利用gE基因中的酶切位点缺失掉PE基因5’端363hP，并把绿色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分，通过酶切鉴定，表明GFP基因已插入到PgEI中，构建了含盯P的缺失转移载体阳B卜0卯。然后在盯P基因表达盒的多克隆位点插入 LacZ基因阅读框，构建了含双报告基因的 PRV－SH转移载体ggE卜GFP乙此载体为改造卯v《H株及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。用DOTAP 转染试剂盒将ggE卜GFPZ车染感染了叩V－洲的B肌－21圭月，待出现so％病变后收获病毒，并以蚀斑法得到纯化的含 LacZ和 GFP两种筛选标记的缺失了 sE儿基因的重组病毒株，命名为rmPRV。 经过对rmPRV的生物学特性及其免疫原性进行了初步研究，结果显示，该疫苗株能在眈细胞上适应生长并形成典型蚀斑，与亲本病毒比较，其在叫细胞上的毒价相刁，m仁＊ 株和rm叩V株nm；。分别为1＊’／．lml和10”’／0．lml。这表明缺失批和gi基困对叩V在M细胞的生长影响不大。PRV－SH和rmPRV对，J、鼠的半数致死量分别为 5．5和 3．68，结果表明卯V－SH tb rmPRV高。在对家兔的实验中，接种相同的病毒量，PRV6H在接种后具有典型的奇痒症状，且在接种后 36，］、时死亡，6 rmPRV接种后 8天左右死亡。这些结果表明