自噬在罗格列酮保护胰岛β细胞中的作用及机制研究2型糖尿病的发病机制主要有两个环节,即胰岛β细胞分泌胰岛素不足和周围组织的胰岛素抵抗。胰岛β细胞的凋亡是造成胰岛β细胞分泌不足的重要原因,如何保护胰岛β细胞一直是2型糖尿病研究中的重点。在临床上,即使非常有效的控制血糖,但β细胞的功能也会逐年恶化。β细胞功能恶化对2型糖尿病发展的决定作用已经在一些临床研究中得到证实。UKPDS研究(United Kingdom Prospective Diabetes Study)、ADOPT研究(A Diabetes Outcome Progression Trial)及Belfast膳食研究(Belfast Diet Study)均显示高血糖恶化与β细胞功能恶化同时发生,采用常规疗法只能减慢而不能阻止其发展。UKPDS报道了与治疗方式无关的高血糖恶化和β细胞功能恶化。ADOPT也报道了类似的结果,无论采用何种药物治疗,β细胞功能恶化与高血糖进展相平行,与UKPDS研究类似,亦发现β细胞功能丧失是导致治疗过程中高血糖进展的主要原因。β细胞凋亡发生于病程早期,糖尿病诊断时就同时存在β细胞功能丧失伴随着β细胞数量的减少。因此,探寻β细胞损伤的机制,通过更加早期和严密的治疗来防止β细胞功能损伤并延缓随之而来的2型糖尿病的进展是我们的当务之急。研究证实自噬(autophagy)有抵抗凋亡的作用。自噬是以细胞质空泡自噬化为特征的溶酶体依赖性的降解途径。自噬是体内长寿蛋白的降解途径,也是唯一的一个降解退化细胞器的方式。自噬既广泛存在于正常的生理过程中,维护着细胞内环境的稳定。自噬的作用主要体现在以下几个方面,自噬通过调控过氧化物体、线粒体和内质网的更新来保持细胞内环境的稳定；自噬在发育过程参与组织的结构重建；自噬是细胞对外源性应激的快速适应性反应,尤其当营养和能量缺乏时；其降解产物氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等可供物质能量循环；当细胞遭受氧化应激和病毒感染时,自噬作为细胞的一种防御机制清除胞质内受损的细胞器、有害的蛋白质等,保护细胞免受损害。自噬抵抗凋亡的作用可能是自噬体通过对受损线粒体的吞噬,防止促凋亡因子如细胞色素和凋亡诱导因子(AIF)的扩散,从而帮助细胞逃逸凋亡新近的研究发现自噬在防止胰岛β细胞凋亡,维持胰岛β细胞的数量及内环境稳定方面发挥着重要作用。研究发现,在用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导的实验性糖尿病模型中,雄性Wistar大鼠的胰岛β细胞对STZ处理的最早的反应是产生自噬,这种自噬是细胞的一种自我保护机制,使胰岛β细胞免受外来有害应激的作用。同样,Choi SE等的研究也表明,自噬作为保护机制能使INS-1细胞免受棕榈酸作用的细胞凋亡。Ebato C等研究发现,在标准饮食下,非糖尿病小鼠的胰岛β细胞维持着很低水平的自噬,但在高脂饮食喂养下,糖尿病和非糖尿病小鼠的胰岛β细胞自噬都出现了显著的激活,在电镜下可以观察到有大量的自噬小体的出现。为了进一步研究自噬的生理功能,Ebato C等构建了胰岛β细胞特异性自噬基因ATG7敲除的小鼠模型(Atg7f/f:RIP-Cre),发现在高脂饮食喂养下,小鼠的β细胞出现凋亡,代偿增殖能力受损,同时还出现退化细胞的增多以及p62蛋白的积累。这个研究表明在应对外来应激的时候,自噬帮助胰岛β细胞清除不必要的和有害的蛋白,保护β细胞免受这些有害物质诱导的细胞凋亡。另外liang j等的研究也进一步证实在自噬缺损的胰岛β细胞,线粒体功能异常导致的ATP和NADPH2产生的减少可诱导细胞凋亡和细胞周期的阻滞。上述的研究表明,自噬是胰岛β细胞的重要保护机制。噻唑烷二酮类(TZD)是一类被广泛应用于临床的治疗糖尿病的药物,目前较多地研究认为格列酮类即可以降糖又可以起到保护胰岛β细胞的作用,但是其保护胰岛β细胞的机制尚不清楚。目前的文献表明TZD类药物是AMPK的激动剂。AMPK的激活被认为可增强骨骼肌和其他组织对葡萄糖的摄取,改善胰岛素抵抗,但其对胰岛β的作用目前尚存在争议。另外,TZD激活AMPK的机制目前还不是特别清楚,一些研究认为它是通过激活非PPARγ受体途径而起的作用。考虑到AMPK激活目前被认为能促进自噬,因此我们推测罗格列酮可能是通过AMPK从而激活自噬的发生,而达到对胰岛β细胞的保护作用。本实验的目的是：阐明自噬在罗格列酮保护胰岛B细胞中的作用及机制。本实验主要由以下四大部分组成：第一部分罗格列酮对高脂作用下胰岛β细胞保护作用的研究应用CCK-8法、克隆形成实验等方法检测罗格列酮对高脂作用下胰岛β细胞死亡的影响,以及通过光镜下观察、AnnexinV/PI双染和DAPI染色检测胰岛β瘤细胞(INS-1细胞)的凋亡情况。结果发现罗格列酮+高脂组较高脂组细胞凋亡减少,表明罗格列酮能保护胰岛β细胞抵抗游离脂肪酸诱导的细胞凋亡。第二部分罗格列酮激活胰岛β细胞自噬的研究应用GFP-LC3转染胰岛β细胞,荧光显微镜下观察成点状荧光的形成情况；westernblot检测LC3II蛋白的表达,以及电子显微镜检测自噬体等方式观察罗格列酮对胰岛β细胞自噬激活的影响。结果发现罗格列酮能激活p细胞自噬。第三部分罗格列酮激活胰岛β细胞自噬的机制研究通过检测罗格列酮作用下胰岛β细胞AMPK磷酸化的高低,以及应用AMPK抑制剂后自噬变化的检测,确定AMPK在罗格列酮激活胰岛β细胞自噬中的作用。结果发现罗格列酮作用下胰岛β细胞AMPK磷酸化增高,抑制AMPK后自噬减少。提示罗格列酮激活自噬可能是通过AMPK这条通路。为了进一步研究自噬在罗格列酮保护胰岛β细胞中的作用,我们进行了第四部分的研究。第四部分抑制自噬对罗格列酮保护作用的影响(1)自噬抑制剂(氯喹、3-MA)预先作用胰岛β细胞,观察其对罗格列酮保护作用的影响。检测内容同第一部分。(2)抑制AMPK后,观察其对罗格列酮保护作用的影响。检测内容同第一部分。结果发现抑制自噬或AMPK后,罗格列酮不能防止高脂诱导下胰岛β细胞凋亡。提示自噬可能是罗格列酮防止胰岛β细胞凋亡的重要机制之一。综合以上四部分的研究结果,我们得出结论：罗格列酮可能是通过激活AMPK从而激活自噬而减少胰岛β凋亡。