视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa, RP)是一种严重的致盲眼病,截止目前临床上仍没有方法能有效阻止疾病进展或重建患者视功能。由于人类从外界获得的信息约90%来源于视觉,视功能的丧失不仅严重影响患者的生活质量,也给社会造成沉重的负担,新兴治疗措施的开发迫在眉睫。基因治疗、移植治疗、神经保护和视觉假体技术等应运而生,并且都取得了初步研究成果;尤其是视网膜假体技术已进入临床试验阶段,通过视网膜下多电极阵列的刺激,完全盲目的RP患者已经能能分辨出字母和简单的物体;给广大RP患者带来了重见光明的希望。但是这些治疗措施得以开展的理论基础和是否能够取得成功在很大程度上依赖于患者内层视网膜的形态和功能。然而对视网膜变性疾病中内层视网膜功能的研究,目前还没有达成一致观点。有一些研究认为,视网膜变性疾病中幸存视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)在感光细胞变性死亡后相当长一段时间内仍能保持特征性的形态和基本电生理功能。Santos等对RP患者进行的研究也发现,变性视网膜中相当多的RGCs能够保持正常的突触连接和功能,并认为这是开展视网膜移植等措施治疗变性疾病的依据。与此同时,另有一些研究者认为,在视网膜变性疾病中,随着感光细胞逐渐变性死亡,内层神经元由于“去传入”而在分子水平、细胞水平和组织水平发生一系列改变,至变性晚期神经元死亡、细胞迁移、微神经瘤和异常神经网络的形成,Müller细胞肥大、增殖形成胶质封闭,导致视网膜形态和功能发生重大的改变—视网膜重构(retinal remodeling)。内层视网膜重构现象的存在给这些处于实验阶段的治疗措施带来了巨大的挑战,也使得这些治疗措施的前景不甚明朗。针对以上焦点问题,本实验室采用皇家外科学院(Royal college surgeon, RCS)大鼠作为视网膜变性的动物模型展开了对内层视网膜形态和功能的一系列研究。我们的研究发现:RCS鼠视网膜变性过程中节细胞层(Ganglion cell layer, GCL)中细胞横径≥12μm的细胞(包含所有的a细胞和极少部分β、γ细胞)密度在变性过程中呈现显著下降的趋势(张晨星等);在外丛状层(outer plexiform layer, OPL)代谢性谷氨酸受体6(Met-glutamic acid receptor 6, mGluR6)的表达深入外核层(outer pexiform layer, ONL),在其周围有突触囊泡蛋白(synaptophysin)表达,提示ON型双极细胞伸出的异常突起有新的功能突触形成;膜片钳单细胞记录发现视杆双极细胞(rod bipolar, RB)的功能发生改变,介于正常的RB和视锥双极细胞(cone bipolar cell, CB)之间(张晨星等);RCS鼠RGCs在变性过程中保持基本正常的形态,但其主动和被动膜学特性与对照组相比发生明显改变,病变晚期RGCs持续放电的能力减弱,至P7-8W时,有26.7%的RGCs在去极化脉冲刺激下不能诱发出动作电位,而P9-12W时63.2%的RGCs不能诱发出动作电位发放(陈中山等)。然而视网膜是一个复杂精细的神经网络,视觉信号的传导不仅依赖细胞各自的基本电生理功能,更依赖细胞之间的协调配合和各自承担的视觉信号传导功能。在视网膜变性过程,在感光细胞逐渐变性死亡以后,内层视网膜中的双极细胞和RGCs承担的视觉信号传导功能发生了怎样的改变,还有待进一步的研究。这在一定程度上更能反映内层视网膜的功能,为各种治疗措施的研究提供理论依据和方向指导。RCS大鼠是一种由于视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell, RPE) Mertk基因突变所导致的遗传性视网膜变性疾病。由于在该模型中,视锥细胞是继发RPE和视杆细胞的变性死亡而较晚出现变性,且只占啮齿类动物感光细胞总数的1-3%,因此早期众多对RCS鼠感光细胞变性特点的研究多忽略了视锥细胞。然而视锥细胞是视网膜中负责高敏度、空间分辨视力和色觉的感光细胞,且在正常大鼠视网膜中1-3%的视锥细胞,却对应至少占双极细胞总数50%的视锥双极细胞,都充分提示视锥细胞在正常视网膜信息传递中具有极其重要的作用。早期研究表明RCS鼠睁眼后视杆细胞迅速开始变性,明显的视杆细胞凋亡开始于出生后(postnatal, P)25天,至P90所有的视杆细胞几乎全部变性死亡。由此我们可以推测,在早期视杆细胞迅速发生变性死亡的病变视网膜中,视锥细胞对内层视网膜功能的影响更是占据了主导地位。基于上述研究现状,本研究在以往对RCS鼠视杆细胞变性规律研究较为成熟的基础上进一步研究视锥细胞的变性特点;进而研究双极细胞接收信号的树突末梢和输出信号的轴突末梢在感光细胞变性的情况下发生了怎样的改变;最后研究感光细胞变性、双极细胞输出信号改变对α-RGCs对光反应的影响。主要研究内容和研究结果如下:第一部分:RCS鼠视网膜变性过程中视锥细胞变性的时空特点。以花生凝集素(Peanut agglutinin, PNA)作为视锥细胞标志物,采用视网膜切片和铺片组化染色相结合的方法,从视锥细胞变性的时间进程和变性分布的空间进展两个方面,观察RCS鼠视网膜变性过程中视锥细胞变性的特点,结果发现:1.RCS鼠视网膜变性过程中,视锥细胞的变性出现于P30,表现为外节缩短,继之内节肿胀、数量减少。P45视锥细胞数量进一步下降,所有的外节消失,内节肿胀程度增加。至P60,后极部视锥细胞的内外节全部消失,仅残余明显膨大的锥细胞足板,P90时,PNA阳性锥细胞足板的数量下降。RCS鼠视网膜变性过程中,视杆细胞睁眼后即开始变性且进展很快,视锥细胞的变性晚于视杆细胞,成为变性视网膜残余视功能的主要来源。2.RCS鼠视网膜变性过程中,视锥细胞的变性从视网膜后极部向周边部进展,表现为周边视网膜残存视锥细胞形态完好、数量较多。在上、下、鼻、颞四个象限中,下方视网膜变性的速度最快,上方变性速度最慢。RCS鼠视网膜变性过程中,视锥细胞沿着视杆细胞变性的轨迹从后极部向周边部进展,且不同象限变性速度不一致。第二部分:RCS鼠视网膜变性过程中感光细胞变性对双极细胞的影响。采用PKCa免疫组化以及双标技术,研究视杆双极细胞的树突末梢在视网膜外丛状层(outer plexiform layer, OPL)中的改变;采用recoverin免疫组化染色显示VIII型视锥双极细胞(属ON型双极细胞)和II型视锥双极细胞(属OFF型双极细胞),定量分析不同亚型双极细胞的轴突末梢,研究了ON和OFF型双极细胞轴突末梢在变性过程中差异性的改变,结果发现:1.RCS鼠视网膜变性过程中,随着视杆细胞逐渐变性死亡,视杆双极细胞自P30开始树突末梢回退,P45时视杆双极细胞末端平坦、树突末梢完全消失;至P60后极部视杆双极细胞伸出粗大的异常突起,P90异常突起数量进一步增加,而周边部的视杆双极细胞极少见生出异常突起。在RCS鼠视网膜变性过程中,由于来自视杆细胞的输入信号减少,视杆双极细胞接受信号的树突末梢发生萎缩,而至变性晚期为寻求其他信号输入维持细胞存活,视杆双极细胞又生长出很多异常粗大的突起。2. RCS鼠视网膜变性晚期,视杆双极细胞异常树突末梢与残存视锥细胞的关系逐渐紧密,至P60可见视杆双极细胞异常树突分支包绕视锥细胞足板的现象,P90可见视杆双极细胞异常突起与视锥细胞足板重叠。提示RCS鼠视网膜变性晚期视杆双极细胞伸出的异常突起可能与残存的视锥细胞形成了突触联系。3.RCS鼠视网膜变性过程中,以视杆双极细胞和VIII型视锥双极细胞为代表的ON通路双极细胞自P30即开始出现轴突末梢减少,而以II型视锥双极细胞为代表的OFF通路双极细胞至P60才出现轻度下降。除此之外,在变性过程中VIII型视锥双极细胞在P30即开始出现胞体数量减少,与此同时II型视锥双极细胞在阳性细胞中所占比例越来越大。RCS鼠视网膜变性过程中,由于由于视杆、视锥不同的变性进程,以及变性后视网膜中特殊的微环境,在双极细胞水平OFF通路比ON通路得以较好的保存。而OFF通路的信号输入全部来自于视锥细胞,进一步证实:随视网膜变性进展,视锥细胞和视锥信号通路逐步成为变性视网膜视功能的主要来源,和影响变性视网膜形态和功能的主导因素。第三部分:RCS鼠视网膜变性过程中α-神经节细胞对光反应的变化。动手搭建光刺激膜片钳实验平台,采用光刺激膜片钳技术研究RCS鼠视网膜变性过程中视网膜α-RGCs对光反应的改变;以及失去对光反应的α-RGCs对去极化脉冲刺激和直接双相电刺激的反应,结果发现:1.在实验室原有膜片钳系统上,成功搭建了由光刺激控制软件、光刺激屏幕、凹透镜和冷光镜(Cold mirror)、光电转换电路板、1440 A/D数模转换器等组成的光刺激实验平台。光路中冷光镜的巧妙使用使得光刺激图案可按一定比例缩小后投射到视网膜上,光电转换电路板的使用以及将其输出信号接入数模转换器实现了光刺激和细胞反应的同步。初步摸索实验条件并总结经验后,成功在正常成年大鼠视网膜上记录到α-RGCs典型的ON和OFF型反应。光刺激实验平台的搭建以及光刺激膜片钳实验技术的建立,使得在单细胞水平研究视网膜中各种细胞的对光反应成为可能,从而可以更自然的反映各种细胞在视觉信号传导中的功能。2.RCS鼠视网膜变性过程中, P30时66.7%的α-RGCs存在对光反应,其中ON/OFF比例=7:11; P45时,仅47.6%的α-RGCs保留对光反应,ON/OFF比例急剧下降为1:4。至P60、P90存在对光反应的α-RGCs比例分别降至21.4%和12.5%,ON/OFF比例进一步下降,至P90记录到的3个存在光反应的细胞均属于OFF型α-RGCs。对ON/OFFα-RGCs的信噪比和光刺激下诱发动作电位发放频率进行统计分析表明,自P30始两种类型的α-RGCs信噪比和诱发频率即开始出现迅速下降,但ON型α-RGCs信噪比下降的速度明显高于OFF型α-RGCs。ON/OFF型α-RGCs比例的改变和信噪比、诱发频率的差异性下降,提示RCS鼠视网膜变性过程中,OFF型α-RGCs的对光反应明显比ON型α-RGCs的对光反应得到较好的保存。OFF型α-RGCs的对光反应依赖于视锥细胞-OFF型视锥双极细胞-OFF型α-RGCs的信号输入,正是由于视锥细胞能在变性视网膜中较长期的存活和OFF视锥信号通路的较好保存,才使得OFF型α-RGCs的对光反应得到较好的保存。在变性晚期视网膜中只记录到OFF型α-RGCs再次证实视锥细胞和信号输入全部来自于视锥细胞的OFF通路,逐渐成为影响变性视网膜功能的主导因素。除此之外,我们还观察到在RCS鼠视网膜变性过程中ON和OFF型α-RGCs的自发放频率呈先升高后降低的变化, ON型波动幅度较OFF型大;无光反应α-RGCs自发放频率则呈逐渐升高的趋势。ON/OFF型α-RGCs自发放频率在变性晚期的下降和无光反应α-RGCs自发放频率的持续升高都是神经元功能受损的表现,而ON/OFF型α-RGCs自发放频率先升高后下降,以及二种类型之间的差异性变化的原因和意义还有待进一步研究。3. RCS P30组顺利形成全细胞模式的无光反应α-RGCs,在去极化脉冲刺激下, 100%能诱发出动作电位。RCS P45组,83.3%的细胞能诱发出动作电位。至P60,诱发动作电位的比例仍高达80%,P90时下降至53.8%。对20pA去极化脉冲刺激诱发动作电位频率进行统计分析表明,随变性进展诱发动作电位频率下降,提示失去对光反应的α-RGCs功能不同程度的受损。另外,对RCS P90组无光反应的α-RGCs施加1V、时间5ms、2ms和1ms的直接双相电刺激,均可以诱发出动作电位持续发放,刺激时间越长动作电位发放的时间也延长。将刺激参数调整为1V、时间1ms,间隔10s,发现每一次刺激诱发出的动作电位发放模式基本相同。这些结果说明,RCS鼠变性视网膜中失去对光反应的α-RGCs仍然保存在去极化脉冲和直接双相电刺激下发放动作电位的能力;RGCs去极化脉冲刺激下发放动作电位能力明显高于光刺激条件下动作电位的发放能力,提示视网膜变性过程中α-RGCs失去对光反应的主要原因是输入信号的缺失;只要有适当、有效的信号输入,变性视网膜中失去光反应的α-RGCs仍能发放动作电位。我们得出以下结论:1. RCS鼠视网膜变性过程中,视锥细胞的变性继发于视杆细胞,沿着视杆细胞变性的轨迹从后极部向周边部进展,幸存的视锥细胞成为变性视网膜残余视功能的主要来源。2. RCS鼠视网膜变性过程中,随着感光细胞逐渐变性死亡,输入信号减少的视杆双极细胞早期出现树突末梢萎缩;至变性晚期为维持细胞存活,后极部视杆双极细胞伸出很多粗大的异常突起。视杆双极细胞部分异常突起可能与残存的视锥细胞之间形成了突触联系。3. RCS鼠视网膜变性过程中,由于视杆、视锥不同的变性进程, OFF通路双极细胞比ON通路双极细胞较晚出现轴突末梢减少,且II型视锥双极细胞(属于OFF型双极细胞)所占比例逐渐增大,在双极细胞水平OFF通路比ON通路得以较好的保存。而OFF通路的信号输入全部来自于视锥细胞,进一步证实:随视网膜变性进展,视锥细胞和视锥信号通路逐步成为变性视网膜视功能的主要来源。4. RCS鼠视网膜变性过程中,越来越多的α-RGCs失去对光反应,保留对光反应的α-RGCs信噪比和光刺激下动作电位发放频率也逐渐下降,但反应细胞中OFF型α-RGCs的对光反应明显比ON型α-RGCs的对光反应得到较好的保存。而OFF型α-RGCs的对光反应依赖于视锥细胞驱动的OFF信号通路,正是由于视锥细胞和OFF视锥信号通路在变性过程中的较好保存,才使得OFF型α-RGCs的对光反应得到较好的保存,逐渐成为影响变性视网膜功能的主导因素。5. RCS鼠视网膜变性过程中,失去对光反应的α-RGCs仍有较高比例的细胞能在去极化脉冲和直接双相电刺激下持续发放动作电位;光刺激和去极化脉冲刺激下动作电位发放能力的差异性说明视网膜变性过程中α-RGCs失去对光反应的主要原因是输入信号的缺失;但随变性进展,去极化脉冲诱发动作电位频率下降提示失去对光反应的α-RGCs功能受损。调整双相电刺激的参数可以使每一次刺激诱发出模式基本相同的动作电位发放,说明只要提供适当、有效的信号输入,变性视网膜中失去光反应的α-RGCs仍能以动作电位的发放来编码刺激信息。但如何选择适于在体条件下的电刺激参数,电刺激是否会导致细胞损伤、刺激本身是否会引起异常视觉,电刺激如何反映来源于外界环境的视觉信息,α-RGCs编码电刺激产生的动作电位是否能通过视神经向视觉中枢传递等问题,都还有待进一步研究。