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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的猪的一种传染病,临床上以妊娠母猪的繁殖功能障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征。PRRSV属于套病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属,为单股正链RNA病毒,基因组长15 kb左右,根据基因型可分为欧洲型和北美型。该病20世纪80年代末和90年代初暴发于北美和欧洲,后蔓延到亚洲及其它地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV在转录过程中会形成一系列有共同5’UTR和3’UTR的亚基因组(sgRNA),这些sgRNA的中间结构为病毒基因组3’端一个或多个蛋白的开放阅读框(Open reading frame,ORF),目前发现转录调控序列(Transcriptional regulatory sequence,TRS,包括位于5’UTR的TRS,即L-TRS和位于基因组内部的TRS,B-TRS)在sgRNA转录过程中发挥重要作用,但PRRSV B-TRS位点多变,至今未完全揭示清楚。本文利用高通量测序技术和病毒反向遗传技术,对PRRSV B-TRS分布规律、类型和功能进行分析,获得结果如下:(1)将PRRSV HuN4毒株感染PAM细胞,感染后48 h收样进行高通量测序,对结果进行分析,发现PRRSV HuN4基因组中有168个有效的B-TRS转录位点;B-TRS碱基构成复杂多样,6个位点可以是任何碱基,但倾向于TTAACC的组合;另外发现,B-TRS的碱基构成与L-TRS(TTAACC)相似度越高,其转录丰度也越高。(2)将PRRSV HuN4毒株分别感染PAM细胞和MARC-145细胞,并在感染后6h、12 h、24 h、36 h和48 h收样进行高通量测序,分析结果显示PRRSV HuN4毒株各转录子(经典的6种sgmRNA)随时间变化而变化:感染后6 h,病毒sgmRNA丰度低于检测阈值;感染后12 h,各转录子丰度比为2.25:1:1:2.5:2:16;感染后24 h,各转录子丰度比为1.2:1:3.4:10.8:8:35;感染后36 h,各转录子丰度比为1.06:1:1.24:3.38:3.46:15.36;感染后48 h,各转录子丰度比为1:1:1.35:3.45:3.69:15.27;PRRSV HuN4毒株在不同细胞上,除了ORF6,各转录子比例基本相同,MARC-145细胞中病毒各转录子丰度比为1:1:1.35:3.45:3.69:15.27;PAM细胞中病毒各转录子丰度比为1:1.09:1.46:3.28:5.03:17.91;另外对sgmRNA结构进行分析,发现PRRSV HuN4毒株sgmRNA至少编码13个潜在的ORF。(3)利用反向遗传操作技术,在PRRSV HuN4基因组中ORF7和3’UTR之间分别插入RFP基因和带有TRS6的RFP基因,两种感染性克隆都可以拯救出重组病毒,但HuN4-RFP毒株不表达红色荧光蛋白,RFP基因与ORF7使用同一条sgmRNA;HuN4-TRS6-RFP毒株可以表达红色荧光蛋白,单独转录出一条sgmRNA,RNA表达量高于ORF7。但传代过程中HuN4-TRS6-RFP毒株的红色荧光蛋白表达不稳定,在第3代RFP基因1到517碱基发生了缺失。综上所述,PRRSV HuN4毒株B-TRS数量远多于已知的12种,且序列形式多样;sgmRNA转录比例在病毒感染后不同时间点存在波动,但不同细胞间sgmRNA转录比例差异不大;PRRSV HuN4毒株sgmRNA至少编码13个潜在的ORF;反向遗传操作分析B-TRS在sgmRNA转录中的作用发现B-TRS的存在对于PRRSV sgmRNA的形成具有重要的作用。