【背景】　　糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种代谢紊乱性疾病，其特征是高血糖、靶组织对胰岛素敏感性不足和/或胰岛素分泌缺陷。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病总发病的80-85％。文献报道显示，T2DM具有多因子遗传性，又与后天生活饮食和行为习惯有密切关系。遗传因素和环境因素共同作用导致T2DM的发生，但遗传因素和环境因素有无相互作用还未见报道。T2DM的典型特征是胰岛素抵抗（Insulinresistance，IR）导致持续性高血糖。尽管T2DM的具体发病机制还不明确，大量的研究证实，氧化应激与T2DM的发生、发展密切相关，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在IR的发生中起着致因性的作用。近些年的研究发现，ROS不仅是体内代谢的垃圾和机体的有害物质，在一定剂量范围内，ROS还作为一种信号分子，对信号传导起着调节作用。　　齐墩果酸（Oleanolicacid，OA）是一种天然三萜系化合物，并且是许多皂苷的苷配基。OA在我国的传统中药中已经有20多年的使用历史，主要是用来治疗肝脏疾病，比如病毒性肝炎。OA吸收后主要在肝脏代谢分布预先给予小鼠OA，可以降低由于化学肝毒物引起的血清丙氨酸转氨酶的升高并减轻肝小叶中心坏死。　　【目的】　　(1)研究氧化应激诱导IR基因敏感性差异。　　(2)探讨ROS对肝细胞胰岛素信号的调节作用及其机制。　　(3)研究OA的抗氧化活性、降血糖和改善肝细胞IR的作用机制。　　【方法】　　(1)氧化应激诱导IR的基因敏感性差异研究。高脂高糖饲料的基础上，给大鼠注射小剂量tBHP，诱导大鼠差异性产生IR。利用基因芯片，筛选实验动物肝组织糖尿病相关基因mRNA表达差异，寻找氧化应激诱导IR的易感性差异基因。并测定实验动物血清、肝、脂肪和肌肉组织的氧化应激相关指标，验证实验动物是否存在氧化损伤的差异。　　(2)ROS信号对肝细胞胰岛素信号的调节作用及其机制研究。采用QZG人正常肝细胞系作为实验对象，利用tBHP、葡萄糖+葡萄糖氧化酶系统和H2O2三种ROS生成系统，以胰岛素刺激的Akt、GSK3α/β和mTOR的磷酸化的改变为判定指标，研究不同浓度ROS生成系统对肝细胞胰岛素信号影响的剂量效应关系。并使用DCFH-DA为探针测定细胞内ROS的生成，分离细胞线粒体，测定线粒体膜电位，通过透射电镜观察线粒体形态，同时使用westernblot和RT-PCR等分子生物学技术测定MAPKs以及氧化应激相关指标的表达，研究氧化还原平衡、线粒体功能等对ROS干扰胰岛素信号的影响。　　(3)OA的抗氧化活性、抗糖尿病和对肝细胞IR的保护作用及其机制研究。通过体外建立羟自由基和超氧阴离子鲁米诺化学发光体系和DPPH自由基生成体系，并在亚细胞水平构建CHP、Vc/Fe2+、CCl4/NADP+激发的微粒体脂质过氧化损伤模型，建立抗氧化活性评价技术平台，检测OA对平台各体系激发生成的自由基及丙二醛含量的影响。并通过tBHP诱导肝细胞氧化损伤，使用DCFH-DA为探针测定细胞内ROS的生成，测定GSH和GSSG含量，MTT测定细胞活力，western blot测定Nrf2、相关抗氧化酶以及MAPKs的表达变化，研究OA对细胞氧化损伤的保护作用，及Nrf2调控的氧化还原平衡和MAPKs的影响。还利用STZ诱导大鼠糖尿病样改变，研究腹腔注射OA对糖尿病大鼠血糖的影响，体外测定OA对α淀粉酶活性的影响，并使用200μMtBHP诱导肝细胞发生IR，westernblot测定胰岛素信号和MAPKs磷酸化的改变，RT-PCR测定氧化应激和糖代谢相关指标，分离线粒体测定线粒体膜电位，研究OA对肝细胞IR的保护作用及可能机制。　　【结果】　　(1)高脂高糖饲料的基础上，给大鼠注射氧化剂tBHP4周后，一部分实验动物（IBG）血糖显著升高并发生IR，而另一部分实验动物（NBG）血糖未发生显著性改变也未发生IR。肝组织糖尿病相关基因芯片结果显示，氧化应激条件下，IBG和NBG组大鼠的糖尿病相关基因出现了明显分离性表达，即一部分为糖尿病性敏感性表达，而另一部分为非敏感性表达，其中变化最为显著的是转录因子2（transcription factor 2，TCF2），也称为肝细胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor，HNF1β）。敏感组较较不敏感组TCF2表达下调60倍以上，不敏感组较正常对照组TCF2表达明显上调。敏感组动物受到明显的氧化损伤，抗氧化能力明显减弱。　　(2)不同剂量的tBHP、葡萄糖+葡萄糖氧化酶系统和H2O2三种ROS生成系统显著地影响了胰岛素刺激的Akt、GSK3α/β和mTOR等信号的磷酸化。总体趋势表现为低剂量ROS促进Akt信号的传导，高剂量的ROS抑制Akt信号，具有一定的剂量效应关系。在三种ROS生成系统中，tBHP和H2O2主要表现为低剂量促进MAPKs的磷酸化，高剂量抑制其磷酸化。葡萄糖+葡萄糖氧化酶系统则随着浓度的升高，MAPKs的磷酸化逐渐增强。低剂量的三种ROS生成系统明显地使抗氧化核心转录因子（Nrf2）表达增强并使细胞抗氧化酶介导的抗氧化防御系统增强，但随着随着ROS浓度的升高，细胞抗氧化防御能力逐渐减弱。低剂量的三种ROS生成系统使TCF2表达显著增强，而高剂量的ROS又使TCF2的表达显著降低。低剂量的tBHP使胰岛素刺激的PCK2mRNA表达显著降低，而随着浓度升高，tBHP又促进PCK2的表达。线粒体膜电位结果显示，低剂量的三种ROS生成系统对线粒体膜电位无显著影响，而在高剂量的条件下，三种ROS生成系统使线粒体膜电位显著降低。此外，透射电镜观察发现200μMtBHP使线粒体明显受到损伤，而给予抗氧化剂明显逆转tBHP对线粒体的损伤。使用线粒体酶复合物Ⅱ抑制剂（3NP）明显地抑制了低剂量tBHP对胰岛素刺激的Akt信号的促进作用。使用线粒体保护剂（环孢霉素A）明显地减弱高剂量tBHP对肝细胞胰岛素信号的抑制作用。不同浓度的tBHP还剂量依赖性地促进以BSA和胰岛素为底物的AGEs的形成。　　(3)自由基模型和脂质过氧化模型结果显示,OA具有一定的自由基清除作用和抑制脂质过氧化作用，但是OA对自由基的直接作用并不强。体外细胞氧化损伤模型结果显示，OA可以明显保护细胞免受氧化损伤，明显抑制tBHP诱导的细胞活力的降低，促进GSH的生成而降低GSSG的含量，并上调Nrf2和抗氧化酶CAT和PRX1的表达，并促进ERK和JNK的磷酸化。OA对糖尿病大鼠的作用显示，预防性和治疗性给予OA都可使糖尿病大鼠血糖显著降低，OA可以有效预防并阻止STZ诱导的T1DM。OA还使大鼠在实验期间体重增加明显减慢。OA明显地保护STZ诱导的大鼠胰腺和肝脏的病理损伤。OA显著地促进正常条件下胰岛素的信号分子传导并明显改善tBHP诱导的IR。预防性或治疗性给予OA明显地促进MAPKs的磷酸化。OA能使tBHP诱导的PCK2的mRNA表达明显降低。OA还明显地保护tBHP对线粒体膜电位的损伤。然而，OA对α淀粉酶活性无明显影响。　　【结论】　　(1)TCF2是决定胰岛素抵抗发生易感性的关键因子。　　高脂高糖氧化应激动物出现IR分离性表现，发现有45％受试动物具有糖尿病易感性，表现为有一系列的基因表达异常，其中Nrf2与TCF2、PPARγ以及其它一系列的抗氧化酶表达的变化趋势非常相似，但TCF2变化最为显著。这些发现表明，TCF2与以Nrf2为核心的氧化还原平衡之间有着密切的关系。TCF2是否为决定生物体在氧化应激条件下发生IR甚至于T2DM的关键因子，有待于进一步证明。　　(2)ROS对肝细胞胰岛素信号具有剂量依赖性的双重调控作用。　　在生理条件下，低剂量的ROS可以促进胰岛素信号的传导，而高剂量的ROS可以干扰胰岛素信号的正常传递，诱导IR的发生，提示ROS对胰岛素信号的作用具有剂量依赖性，ROS水平的变化起着双刃剑的作用。Nrf2调控的氧化还原平衡可能是ROS调节胰岛素信号的关键。此外，MAPKs和线粒体功能可能是介导ROS调节胰岛素信号的重要因素。　　(3)OA可以Nrf2为靶点有效地降低血糖、改善肝脏胰岛素抵抗。　　OA具有自由基清除作用，是一种可以通过生物学作用诱导抗氧化防御系统而间接发挥抗氧化作用的抗氧化剂。与自由基清除作用相比，OA的间接生物学作用更为重要。OA通过诱导Nrf2上调抗氧化酶的表达，进而促进GSH的生成而发挥抗氧化作用，可能主要通过间接地激活关键转录因子和抗氧化酶系统而发挥抗氧化作用。此外，JNK和ERK的磷酸化参与OA发挥抗氧化作用，而且在MAPKs和Nrf2之间很可能存在某种cross-talks。OA可以降血糖、改善肝脏IR、抑制肝糖异生。而OA的减轻体重、抗氧化作用、对ERK和JNK两种氧化应激敏感激酶的激活以及对线粒体的保护作用等功能可能是OA抗糖尿病作用的重要机制。我们的研究表明OA在治疗糖尿病领域的应用将具有非常重要的意义。