背景和目的牙周炎是一种口腔细菌感染性疾病,主要由细菌引起的炎症和机体免疫应答反应造成的局部骨组织破坏及改建内稳态失衡引起。在牙周炎的发生发展过程中,多种炎性细胞因子参与牙周组织破坏过程,研究较多的是肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、IL-6等。其中,TNF-α被认为是牙周组织炎性微环境中重要的内源性促炎因子,在牙周炎的发生、发展过程中起重要作用,影响牙周再生。牙周病治疗的目的是重建因炎症因子破坏的牙周组织,恢复其形态和功能即牙周再生。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周组织再生领域研究的重要细胞。PDLSCs是从人牙周膜韧带组织中获得的间充质干细胞,具有多向分化潜能等干细胞特性,是牙周组织再生修复的重要种子细胞,其增殖与分化也是决定牙周再生成功与否的关键因素之一。PDLSCs的活性受牙周炎症微环境的影响,炎性因子TNF-α能使其成骨能力降低。TNF-α可通过介导其它炎症介质的产生促进炎症反应,诱导破骨细胞的形成以及抑制成骨分化,同时抑制牙周膜干细胞向成骨细胞转化从而抑制骨形成,被认为是牙周组织再生的关键影响因子。因此,拮抗TNF-α及其介导的相关通路的策略有望应用于牙周炎的辅助治疗。TNF-α介导的成骨分化抑制主要与核因子(nuclear factor-κB,NF-κB)、Eph B4等信号通路相关。TNF-α具有两种受体:肿瘤坏死因子受体-1(TNF receptor-1,TNFR1)和肿瘤坏死因子受体-2(TNF receptor-2,TNFR2)。TNFR1在所有类型细胞上均有表达,是TNF-α主要的结合受体,主要促进炎性反应发生以及细胞凋亡,激活NF-κB信号通路抑制成骨分化。TNFR2主要在免疫细胞、神经元细胞、内皮细胞中表达,参与信号传递和T细胞增殖等过程,具有促进成骨分化作用。多功能生长因子颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)是一种自分泌生长因子,广泛存在于各组织和细胞,在炎症、肿瘤、创伤愈合、软骨发育等生理病理过程中具有重要作用。研究报道,PGRN能与肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合,阻断TNF-α介导的破骨细胞分化及成骨分化的抑制作用并且PGRN又能直接促进成骨分化及骨缺损愈合。相比传统的抗TNF-α治疗方案,PGRN有望成为既能诱导PDLSCs成骨分化,又具有抗炎作用的新一代牙周炎治疗生物因子。在本课题组前期实验中,PGRN已被证实可通过抗炎、抑制破骨细胞和促进成骨分化进而促进大鼠炎症性牙周骨缺损的再生并且对牙周炎小鼠及患者的牙龈组织均具有抗炎保护性作用;此外,体外实验初步证实,PGRN对PDLSCs成骨分化有直接促进作用且对TNF-α介导的PDLSCs成骨分化抑制有拮抗作用,然而作用机制尚未明确。PGRN与TNFR具有较高亲和力,而TNFR是TNF-α的受体。因此,本文拟通过构建慢病毒转染TNFR1和TNFR2基因敲除的PDLSCs靶细胞,探讨PGRN直接促进成骨分化及拮抗TNF-α介导的PDLSCs成骨分化抑制作用的相关信号通路及其作用机制,包括TNFRs及其下游信号通路所介导的作用,为PGRN在牙周病治疗中的应用提供实验依据。材料与方法1.健康人PDLSCs的体外分离、培养及鉴定1.1 PDLSCs的体外分离、培养和克隆选取山东大学口腔医院因正畸治疗需要而拔除的健康前磨牙以及年轻患者拔除的第三磨牙,刮取牙根中1/3部分牙周膜组织块,运用组织块培养法体外分离培养PDLSCs,采用有限稀释法克隆化培养PDLSCs,观察原代培养的PDLSCs的形态特征,并检测PDLSCs的克隆形成率。取生长状态良好的细胞用于后续实验。1.2 PDLSCs的多向分化能力取生长状态良好的P3～P5代细胞,用于PDLSCs成脂、成骨、成神经元诱导分化实验,鉴定PDLSCs的多向分化能力。选取细胞状态良好的P3代细胞,用配制好的成脂诱导培养液诱导PDLSCs向脂肪细胞分化,诱导21 d后用油红O染色,观察脂肪滴的形成情况;用配制好的成骨矿化诱导液培养细胞,诱导28 d用茜素红染色观察钙化结节形成情况,培养7 d后用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒染色观察显色情况;取生长状态良好的P3～P5代PDLSCs,制备细胞爬片,然后用配制好的神经诱导液培养2～3 d,共聚焦荧光显微镜下观察细胞免疫荧光染色结果。1.3 PDLSCs相关表型的鉴定取生长良好的P3～P5代PDLSCs,分别加入提前分装稀释的CD105、CD34、CD45、CD90、CD44、STRO-1相关单克隆抗体,采用流式细胞技术检测PDLSCs的表面相关表型分子的表达量。2.PGRN促进PDLSCs成骨分化的作用机制2.1 PDLSCs 中 TNFR1、TNFR2 的表达选取生长良好的P3～P5代PDLSCs,采用细胞免疫荧光法检测PDLSCs细胞中 TNFR1、TNFR2 的表达,采用 qRT-PCR 法检测 PDLSCs 中 TNFR1 和 TNFR2的mRNA表达。2.2 PDLSCs中TNFR1和TNFR2基因敲除利用CRISPR/Cas9技术敲除TNFR1和TNFR2基因,设计识别TNFR1和TNFR2基因靶位点的sgRNA,构建表达sgRNA的慢病毒载体及表达cas9蛋白的慢病毒载体共转染至 PDLSCs,感染 LV-TNFR1-sgRNA(02682、02683、02684)、LV-TNFR2-sgRNA(02673、02674、02675)和 LV-sg-NC 慢病毒颗粒后,得到TNFR1 和 TNFR2 基因敲除的 PDLSCs-sh-TNFR1、PDLSCs-sh-TNFR2 及相应的对照细胞PDLSCs-NC。荧光显微镜下观察细胞,流式细胞技术检测慢病毒感染PDLSCs的感染效率,选取最佳MOI值及最佳转染条件,然后分别采用qRT-PCR和Western blotting实验验证PDLSCs中TNFR1和TNFR2基因的mRNA和蛋白表达量,判断基因敲除效率,选取最佳慢病毒颗粒用于后续实验转染得到靶细胞。2.3 PGRN对PDLSCs及TNFR2基因敲除的PDLSCs成骨分化调控因子表达的影响在本课题组前期研究中,25 ng/mL的PGRN对PDLSCs成骨分化作用最明显,因此本实验PGRN的剂量选用25 ng/mL。将25 ng/mL的PGRN作用于PDLSCs-sh-TNFR2及PDLSCs-NC两组细胞,每组细胞分两组:①空白对照组、②25 ng/mL PGRN组,分别在含成骨诱导培养基中培养3 d和7 d,采用qRT-PCR和Western blotting实验检测成骨标志物Runx2、ALP的mRNA和蛋白表达。2.4 PGRN调控PDLSCs成骨分化的MAPK相关信号通路的影响(1)将PDLSCs细胞在无血清培养基内用浓度为25 ng/mL的PGRN刺激下培养 0、5、15、30、60、120min 后提取蛋白,Western blotting 检测 MAPK 通路相关蛋白(ERK1/2/p-ERK1/2,JNK/p-JNK)水平的表达。(2)根据上述结果,选取PGRN处理时间为15 min。用25 ng/mL的PGRN分别刺激 PDLSCs-sh-TNFR1,PDLSCs-sh-TNFR2 和 PDLSCs-NC 三种细胞各 15 min提取蛋白,并采用Western blotting检测P-ERK1/2和P-JNK的表达。(3)为了进一步阐明ERK1/2和JNK信号通路是否与PGRN刺激的成骨分化有关,将PDLSCs细胞在成骨诱导液中培养,根据文献及预实验对ERK1/2和JNK信号通路抑制剂U0126和SP600125的浓度进行了筛选后,分别加入U0126(10μm/L)和SP600125(20μm/L)阻断相应的信号通路,再加入25 ng/mLPGRN刺激培养3 d和7 d,采用qRT-PCR和Western blotting分别检测成骨标志物Runx2和ALP的mRNA和蛋白表达。3.PGRN拮抗TNF-α对PDLSCs成骨分化抑制的作用机制研究3.1 PGRN对TNF-α刺激下PDLSCs-NC成骨分化的影响将 PDLSCs-NC 分别在含①10 ng/mL TNF-α;②25 ng/mL PGRN;③10 ng/mLTNF-α+25 ng/mL PGRN;④空白对照的成骨诱导培养基中分别培养3d和7 d,qRT-PCR和Western blotting方法分别检测每组细胞成骨标志物Runx2、ALP mRNA和蛋白的表达。3.2 PGRN对TNF-α刺激下TNFR基因敲除的PDLSCs成骨分化的影响PDLSC-sh-TNFR1、PDLSCs-sh-TNFR2 两组细胞分别在含①10 ng/mL TNF-α;②25 ng/mL PGRN;③10 ng/mL TNF-α+25 ng/mL PGRN;④空白对照的成骨诱导培养基中分别培养3 d和7 d,采用qRT-PCR和Western blotting实验检测成骨标志物Runx2和ALP的mRNA和蛋白表达。3.3 PGRN对TNF-α刺激下PDLSCs中NF-κB信号通路的影响将PDLSCs细胞在无血清培养基内用10 ng/mLTNF-α刺激下培养0、5、15、30、60、120min后,Western blotting检测NF-κB通路的重要成员p-p65的表达,结果显示p-p65在5 min时表达明显增加,并随时间降低。然后将PDLSC-sh-TNFR1、PDLSCs-sh-TNFR2 及 PDLSCs-NC 三种细胞分别在含①10 ng/mLTNF-α;②25 ng/mL PGRN;③10 ng/mLTNF-α+25 ng/mL PGRN 和④空白对照的无血清培养基内刺激5 min后提取蛋白,Western blotting检测p-p65的蛋白表达情况。结果1.体外分离、培养的健康人PDLSCs具有间充质干细胞的特征1.1 PDLSCs的体外分离、培养和克隆原代细胞一般一周左右从组织块周围爬出贴壁生长增殖;将原代细胞传代克隆培养后,细胞多呈圆形、梭形等形态,但都表现为胞核聚集在中心,核仁明显,胞质形成的突起向外呈放射状,具有成体干细胞的形态特征。克隆纯化培养的细胞有明显的生长潜伏期、对数生长期和平台生长期,符合细胞生物学的生长规律;用结晶紫染色可观察到紫色的细胞团。1.2 PDLSCs的多向分化能力将PDLSCs在成脂诱导结束后,使用油红O染色,光学显微镜下实验组可观察到大量脂滴的形成。成骨矿化诱导28 d后茜素红染色,结果显示实验组光镜下可观察到明显的矿化结节,碱性磷酸酶显色实验呈阳性。成神经诱导细胞免疫染色结果显示细胞表面高度表达神经干细胞表面特异性标志物Nestin。这表明源自单细胞克隆的PDLSCs具有间充质干细胞的多项分化能力。1.3 PDLSCs表达间充质干细胞表面标记使用流式细胞仪检测细胞表面标志物显示:PDLSCs对间充质干细胞表面标记CD44(99.9%)、CD90(100%)、CD105(100%)和 STRO-1(14.2%)均呈阳性表达,并且造血分子表面标记CD34(0.76%)和CD4(0.25%)的表达呈阴性。2.PGRN促进PDLSCs成骨分化的作用机制2.1 PDLSCs中TNFR1和TNFR2呈阳性表达细胞免疫荧光染色结果显示TNFR1和TNFR2在PDLSCs中均呈阳性表达;qRT-PCR检测结果显示TNFR1和TNFR2在PDLSCs中均呈阳性表达,而TNFR1表达水平相对TNFR2更高。2.2转染后PDLSCs中TNFR1和TNFR2表达量显著降低经试验,慢病毒转染最佳MOI值为30,选用P3代细胞进行转染试验。PDLSCs分别感染LV-TNFR1-sgRNA和LV-TNFR2-sgRNA后,与对照组相比,LV-TNFR1-sgRNA-02682 和 LV-TNFR2-sgRNA-02673 在 PDLSCs 中分别显示出TNFR1和TNFR2最高的敲除效率,TNFR1和TNFR2的mRNA和蛋白表达水平降低具有统计学意义(P<0.05)。因此,LV-TNFR1-sgRNA-02682和LV-TNFR2-sgRNA-02673 转染的 PDLSCs(分别命名为 PDLSCs-sh-TNFR1 和PDLSCs-sh-TNFR2)被用于进一步的基因敲除后的分析。2.3 PGRN通过TNFR2促进PDLSCs成骨分化(1)PGRN促进PDLSCs成骨分化:与对照组比较,qRT-PCR和Western blotting结果显示PGRN处理组PDLSCs中RUNX2和ALP的mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05),表明PGRN可以促进PDLSCs成骨分化。(2)TNFR2 介导了 PGRN 的促 PDLSCs 成骨分化:qRT-PCR 和 Western blotting检测结果显示,PDLSCs-sh-TNFR2经PGRN处理后RUNX2和ALP的mRNA和蛋白表达与对照组比较无显著差异(P>0.05),PGRN的促成骨分化作用在PDLSCs-sh-TNFR2中消失,说明TNFR2介导了 PGRN的促PDLSCs成骨分化。2.4 PGRN促PDLSCs成骨分化作用与MAPK信号通路激活有关2.4.1 PGRN可激活ERK1/2、JNK信号通路Western blotting 结果显示:在 PGRN 作用下,PDLSCs 中 p-ERK1/2/ERK 1/2,p-JNK/JNK蛋白水平分别在5min、15min显著上升(P<0.05)。2.4.2 TNFR2介导了 PGRN对JNK信号通路的激活用 25 ng/mL 的 PGRN 分别刺激 PDLSCs-sh-TNFR1、PDLSCs-sh-TNFR2 和PDLSCs-NC 三组细胞 15 min 后,Western blotting 结果显示:PDLSCs-NC 和PDLSCs-sh-TNFR1中p-ERK1/2和p-JNK的蛋白表达与对照组相比显著增强(P<0.05)。然而,PDLSCs-sh-TNFR2中p-JNK蛋白表达与对照组比较没有显著变化,但p-ERK1/2的表达仍增强,表明TNFR2介导了 PGRN对JNK信号通路的激活。2.4.3 ERK、JNK通路抑制剂抑制PGRN的促成骨分化作用与对照组比较,PGRN处理组PDLSCs中ALP和RUNX2表达量在蛋白和mRNA水平上均显著增高(P<0.05);而加入ERK1/2和JNK信号通路抑制剂U0126和SP600125阻断相应的信号通路后,PDLSCs中ALP和RUNX2表达量在蛋白和mRNA水平上均显著降低(P<0.05)。由此可见,PGRN增强成骨调控因子ALP和RUNX2的表达从而促进PDLSCs成骨分化过程与激活ERK1/2和JNK信号通路相关。3.PGRN拮抗TNF-α介导的PDLSCs的成骨分化抑制的作用机制3.1 PGRN对TNF-α诱导的PDLSCs成骨分化抑制的拮抗作用与对照组比较,qRT-PCR和Western blotting结果显示TNF-α处理的PDLSCs中RUNX2和ALP的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),PGRN处理组RUNX2和ALP的表达显著升高(P<0.05),而PGRN+TNF-α处理组RUNX2和ALP的mRNA和蛋白表达显著高于单独的TNF-a处理组(P<0.05),表明PGRN对TNF-α诱导的PDLSCs的成骨分化抑制有拮抗作用。3.2 PGRN对TNF-α诱导的PDLSCs成骨分化抑制的拮抗作用由TNFR1介导在PDLSCs-sh-TNFR1细胞,与空白对照组比较,TNF-α刺激组RUNX2、ALP mRNA和蛋白表达无显著差异,而TNF-α+PGRN刺激组RUNX2、ALP mRNA和蛋白表达显著高于对照组及TNF-α组(P<0.05)。在PDLSCs-sh-TNFR2细胞,与空白对照组比较,RUNX2、ALP mRNA和蛋白表达在TNF-α刺激组显著降低,TNF-α+PGRN组的RUNX2、ALP mRNA和蛋白表达低于对照组,而显著高于TNF-α组。鉴于PGRN是已知的TNFR1阻断剂,由此推测,PGRN逆转TNF-α抑制的PDLSCs中成骨调控因子的表达由TNFR1介导。3.3 PGRN抑制TNF-α激活的NF-κB信号通路在PDLSCs细胞中,随着TNF-α作用时间延长p-p65蛋白表达随时间推移先增加后降低,说明TNF-α通过激活NF-κB信号通路发挥成骨抑制作用。在PDLSCs-sh-TNFR1 中,TNF-α 和 TNF-α+PGRN 刺激组 p-p65 表达无显著差异(P＞0.05),而在 PDLSCs-NC 和 PDLSCs-sh-TNFR2 中,PGRN 拮抗 TNF-α 增强的p-p65表达(P<0.05)。这些结果以及我们之前实验结果表明,PGRN通过结合TNFR1逆转TNF-α对NF-κB信号通路的激活,从而拮抗TNF-α介导的抑制成骨作用。结论1.PGRN可以直接促进PDLSCs成骨分化,该作用与激活ERK1/2和JNK信号通路有关,而且TNFR2介导PGRN对JNK信号通路的激活。2.TNF-α可通过TNFR1激活PDLSCs中的NF-κB信号通路,抑制其成骨分化。3.PGRN逆转TNF-α对PDLSCs的成骨分化的抑制作用。该作用主要通过TNFR1竞争性拮抗TNF-α,进而抑制NF-κB信号通路的激活。