食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、发病隐匿、易转移和死亡率高等特点,河南省是其高发省份。目前治疗方法主要有手术、化疗放疗等,对中、晚期食管癌均有一定的局限性且疗效不能令人满意。因此,寻求食管癌生物治疗的新靶点和新途径已成为近年来的研究热点之一。近年来,研究发现很多在胚胎发育、组织分化过程中起调控作用的信号通路同样在肿瘤发生的过程中发挥着重要的作用,其中包括Sonic hedgehog信号通路、EGFR信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路等。Smoothened (Smo)蛋白是Sonic hedgehog信号通路中的信息转换器,能够把细胞外的SHh信号转换成细胞内的Glil信号,从而启动细胞核内基因的转录,对Sonic hedgehog信号通路具有激活作用。正常组织和细胞中,Smo不表达或低表达,维持细胞正常代谢需要。当Smo过表达时,可异常激活Hedgehog通路,产生大量促癌因子使细胞发生转化和恶变。研究表明,Smo在一些人类肿瘤,如恶性胶质瘤、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、基底细胞癌等组织中高表达。有学者认为,Smo有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和早期诊断、评估预后的新指标。Gli基因家族最初是在人类恶性胶质瘤中扩增Glil时被确认的。人类有种Gli同源基因：Gli、Gli2、Gli3。Gli1基因编码1106个氨基酸的蛋白质,定位于染色体12q13,作为脊椎动物的转录效应器,穿梭于细胞浆和细胞核之间,将转录信号由细胞浆传递进细胞核。Glil蛋白不能被蛋白酶所水解,只能以全长的状态存在于细胞质内,通过自身不同长度对细胞核内下游基因起转录或抑制作用,所以,Glil蛋白只具有转录激活作用。另有研究表明,使用RNA干扰技术抑制胃癌细胞系中Smo表达的同时可降低Glil的表达量。有关在食管癌中使用RNAi技术抑制Smo、Glil表达的研究迄今尚未见文献报道。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种在动植物中普遍存在的通过双链RNA (double strand RNA, dsRNA)在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程。dsRNA进入细胞后,在dsRNA核酸酶(Dicer)作用下,被裂解成21bp-23bp的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA), siRNA与一种多聚核酸酶复合物结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silence complex, RISC), RISC同与siRNA互补的mRNA结合,发挥RNA酶作用酶解mRNA,属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)的一种。目前应用RNAi技术在细胞信号传导通路、抗病毒、抗肿瘤等领域的实验研究广泛深入开展,标志着RNAi必将成为研究基因功能不可或缺的工具。本研究应用RNAi技术特异性抑制食管癌EC9706细胞中Smo表达,采用免疫细胞化学、原位杂交等技术检测转染前后EC9706细胞中Smo> Gli1蛋白及mRNA的表达情况,应用Boyden chamber体外侵袭实验观察转染前后细胞侵袭力的变化,为临床应用RNAi技术靶向治疗食管癌提供理论依据。材料和方法1.人食管癌EC9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。2.食管癌EC9706细胞的培养：食管癌EC9706细胞于RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml),37℃、5%CO2孵箱内贴壁培养。3. siRNA的体外合成、鉴定及筛选：首先设计合成siRNA的寡核苷酸模板,5’端为T7启动子序列,在体外和T7RNA聚合酶特异性结合转录出目的siRNA。分别合成两段特异性siRNA和一段无义对照siRNA,应用4%琼脂糖凝胶电泳,以定量模板DNA为参照,测定siRNA的长度和浓度；通过预实验筛选出一段干扰效果较好的特异性siRNA。4.转染：应用LipofusinX脂质体将siRNA转染EC9706细胞。5.应用免疫细胞化学SP法,检测转染前后各实验组、对照组中Smo和Glil蛋白的表达情况。6.应用细胞原位杂交技术,检测转染前后各实验组、对照组中Smo和Glil mRNA的表达情况。7.应用Boyden chamber体外侵袭实验观察转染前后细胞侵袭力的变化。8.统计学处理：应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,计量资料采用均数±标准差(X±S)表示；两组均数的比较用t检验(t-test);两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA);以a=0.05为显著性标准。结果1.成功体外合成两条siRNA,长度均为21bp。2.EC9706细胞形态学变化：Smo特异性siRNA转染食管癌EC9706细胞后,可见细胞逐渐变圆,折光增强,继而开始皱缩,漂浮。3.免疫细胞化学结果：150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl三种不同浓度的特异性Smo siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,Smo Glil蛋白表达量均有所降低,其中以250ng/μl转染72h的抑制效应最为明显,各实验组与细胞对照组(不转染)、空白对照组(空脂质体)、无义对照组(转染无义siRNA)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)；每个浓度组内随转染时间增加抑制效应增强,三个时间段两两相比差异无统计学意义(P>0.05);每个时间段内随转染剂量增加抑制效应逐渐增强,三种浓度两两相比差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组、无义对照组与细胞对照组相比均未表现出对Smo、Glil蛋白表达的抑制效应,三个对照组两两相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.原位杂交结果：150ng/μl、200ngng/μl、250ng/μl三种不同浓度的特异性Smo siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,Smo、Glil mRNA表达量均有所降低,其中以250ng/μl转染72h的抑制效应最为明显,各实验组与细胞对照组、空白对照组、无义对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)；每个浓度组内随转染时间增加抑制效应增强,三个时间段两两相比差异无统计学意义(P>0.05)；每个时间段内随转染剂量增加抑制效应逐渐增强,三种浓度两两相比差异有统计学意义(P<0.05)；细胞对照组、空白对照组与无义对照组相比均未表现出对Smo、Glil mRNA表达的抑制效应,三个对照组两两相比差异无统计学意义(P>0.05)。5. Boyden chamber体外侵袭实验结果：Smo siRNA体外转染食管癌EC9706细胞后,穿越Matrigel的细胞数明显少于细胞、空白和无关对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1. Smo siRNA可特异性抑制食管癌EC9706细胞中Smo蛋白及mRNA的表达。2. Smo siRNA在下调食管癌EC9706细胞中Smo蛋白和mRNA表达的同时,Glil蛋白及mRNA的表达亦随之下调,提示Smo能通过Sonic Hedgehog通路影响Glil的表达。3.特异Smo siRNA在下调食管癌EC9706细胞中Smo、Glil表达的同时,细胞生长缓慢,部分细胞死亡,细胞侵袭力显著减弱,表明Smo siRNA可抑制食管癌EC9706细胞的浸润转移。