一、研究目的及意义:通过检测吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对大鼠肝癌细胞CBRH7919GJIC功能的影响,以筛选出能促进CBRH7919细胞GJIC功能的中药活性成分;并进一步定量检测筛选出的活性成分对CBRH7919细胞GJIC功能的影响;在此基础上再检测该活性成分对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响,以了解该活性成分对GJIC功能是否有促进作用;并进一步检测该活性成分对CBRH7919细胞Cx26和Cx32表达的影响,以期探讨该活性成分影响CBRH7919细胞GJIC功能的机制,为临床综合治疗肿瘤和拓展中药的新用途提供实验依据。二、研究方法:1.检测吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞的作用:分别用终浓度为OμM、0.078125μM、0.15625μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM的吴茱萸碱和终浓度为0μM、12.5μM、25μM、50gM、100μM、200μM、400μM的松果菊苷及淫羊藿苷以及终浓度为0μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM葫芦巴碱作用CBRH7919细胞48hrs。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞存活率。2.检测吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:分别用终浓度为0.25gM吴茱萸碱和50gM松果菊苷及淫羊藿苷以及100μM葫芦巴碱作用CBRH7919细胞48hrs,然后采用划痕标记染料示踪技术(scrape-loading dyetransfer assay,SLDT)检测各组细胞GJIC功能。3.检测松果菊苷对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:分别用终浓度为25μM、50μM、100μM的松果菊苷作用CBRH7919细胞24hrs和48hrs,然后采用预标记双染料传输技术(preloading and dye transefer)及流式细胞术检测各组细胞GJIC功能。4.检测松果菊苷对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响:用终浓度为25μM、50μM、100μM的松果菊苷与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用CBRH7919Rk细胞以及含10%CBRH7919/tk~+细胞的CBRH7919/tk~±混合细胞48hrs。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞抑制率,两两比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,并用金正钧Q值分析松果菊苷与HSV-tk/GCV系统联合的相互作用是否具有协同性。5.检测松果菊苷对CBRH7919细胞Cx26和Cx32表达的影响:分别用终浓度为25μM、50μM、100μM的松果菊苷作用CBRH7919细胞24hrs和48hrs,然后采用FITC间接免疫荧光染色,倒置显微镜观察和流式细胞仪检测各组细胞表达Cx26和Cx32的阳性细胞数及荧光强度;采用Western-blot技术检测各组细胞Cx26和Cx32的表达量。三、研究结果:1.吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞的作用:镜下观察可见,空白对照组细胞生长状况良好,贴壁很稳,密度高,细胞呈梭状、菱形、三角形或多边形;与对照组细胞相比,吴吴茱萸碱0.625μM及以上浓度组、松果菊苷200μM及以上浓度组、淫羊藿苷200μM及以上浓度组、葫芦巴碱400μM及以上浓度组均出现细胞数目减少、贴壁的细胞非常少、细胞碎片很多、细胞大部分死亡(细胞变圆、脱落),吴茱萸碱各浓度组细胞存活率分别为:107.81±0.01%、111.25±0.01%、103.26±0.01%、87.00±0.02%、71.91±0.01%、64.81±0.02%;松果菊苷各浓度组细胞存活率分别为:104.90±0.03%、112.26±0.02%、112.79±0.01%、112.31±0.01%、91.44±0.02%、60.79±0.01%;淫羊藿苷各浓度组细胞存活率分别为:102.89±0.01%、106.49±0.01%、113.64±0.03%、115.12±0.02%、109.19±0.01%、99.97±0.02%;葫芦巴碱各浓度组细胞存活率分别为:99.84±0.02%、98.76±0.02%、97.06±0.02%、87.27±0.00.02%、85.31±0.04%、84.72±0.04%。2.吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:空白对照组细胞的荧光染料主要出现在划痕旁1列细胞中,半定量为(±),荧光亮度低,细胞间染料传输功能差;与空白对照组细胞相比,细胞经0.25μM吴茱萸碱作用48hrs后的CBRH7919细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的2～3列细胞内,半定量为(++),荧光亮度增加,细胞间染料传输功能增强;细胞经50μM松果菊苷作用48hrs后的CBRH7919细胞中,荧光染料出现在划痕的附近细胞内至划痕以外的5～6列甚至7～8列细胞内,半定量为(++++),形成连片状的荧光染色,荧光亮度明显增加,细胞间染料传输功能显著增强;细胞经50μM淫羊藿苷及100μM葫芦巴碱作用48hrs后的CBRH7919细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的1～2列细胞内,半定量为(+),荧光亮度稍增加,细胞间染料传输轻微增强。3.松果菊苷对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:流式细胞仪测定结果显示,与空白对照组相比,经松果菊苷作用24hrs后,松果菊苷25μM组、50μM组、100μM组的红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例增加,并且随着松果菊苷浓度的增加,红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例逐渐增加,但增加的幅度不大;经松果菊苷作用48hrs后,松果菊苷25μM组、50μM组、100μM组的红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例进一步增加,与空白对照组相比,增加的幅度明显增大。但松果菊苷终浓度100μM组与终浓度50μM组相比,红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例不再上升,比终浓度50μM组略低。4.松果菊苷对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响:镜下观察发现,空白对照组和松果菊苷组细胞生长状况良好,细胞贴壁很稳,细胞密度高,细胞呈梭状、菱形、三角形或多边形;GCV组细胞数目减少,细胞密度减低,小部分细胞死亡(细胞变圆、脱落);松果菊苷联合GCV组均出现细胞数目减少、细胞密度减低、贴壁的细胞减少、细胞死亡(细胞变圆、脱落)数增加;用25μM、50μM、100μM浓度的松果菊苷联合10%tk~+/GCV组的细胞抑制率(%)分别为16.74±0.05、17.16±0.06、18.88±0.07,与单纯10%tk~+/GCV组(7.31±0.08)和相应的各浓度单纯松果菊苷组(2.31±0.07、3.11±0.05、4.62±0.04)的抑制率相比明显要高。各组细胞实际抑制率和理论抑制率的两两比较及金正钧Q值计算结果显示,25μM、50μM、100μM浓度下的松果菊苷联合10%tk~+/GCV组的实际抑制率(分别为16.74、17.16、18.88)显著高于理论抑制率(分别为9.45、10.19、11.59),金正钧Q值分别为1.77、1.68、1.62,均大于1.15,说明其增效作用为协同作用。5.松果菊苷对CBRH7919细胞Cx26和Cx32表达的影响:用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果显示,与空白对照组相比,经松果菊苷作用后,CBRH7919细胞表达Cx26和Cx32的阳性细胞数增多、荧光强度增强。Western-blot测定结果显示,与空白对照组相比,经松果菊苷作用后,CBRH7919细胞Cx26和Cx32的表达量增加,并呈一定的剂量效应依赖关系。四、结论:1.吴茱萸碱对细胞对大鼠肝癌细胞CBRH7919有较强的细胞毒性;松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞的细胞毒性较弱。2.在筛选的四种中药活性成分中,松果菊苷能显著促进和恢复CBRH7919细胞GJIC的功能,故选取松果菊苷作为进一步观察影响CBRH7919细胞GJIC功能的药物。今后在研究药物影响细胞GJIC的实验中,划痕标记染料示踪实验可以作为初步筛选待选药物的指标。3.松果菊苷具有上调大鼠肝癌细胞CBRH7919 GJIC功能的作用,并呈一定的剂量效应效应依赖关系。4.松果菊苷联合HSV-tk/GCV系统能显著地提高tk~+、tk~-混合细胞对GCV的敏感性,具有明显增强HSV-tk/GCV系统的杀伤效应的作用,而且松果菊苷对HSV-tk/GCV系统杀伤肿瘤细胞的增效作用是一种协同性相互作用。松果菊苷可能通过提高HSV-tk/GCV系统旁观者效应来实现这种协同性增效作用,其机制可能主要是松果菊苷促进和恢复了CBRH7919细胞GJIC的功能。5.松果菊苷对大鼠肝癌细胞CBRH7919 Cx26和Cx32的表达有促进作用,并呈一定的剂量效应依赖关系,而且可能促进Cx26和Cx32的靶向输送,使表达的Cx26和Cx32主要分布在细胞膜上,有利于细胞间通讯。6.松果菊苷可能通过促进大鼠肝癌细胞CBRH7919 Cx表达、成熟与定位分布,在一定程度上恢复了Cx介导的GJIC功能,重新建立细胞间连接,进而提高HSV-tk/GCV系统旁观者效应来实现与HSV-tk/GCV系统协同性增效作用。