药物代谢是药物发现和开发阶段的研究重点，阐明药物体内处置过程，了解代谢位点，有助于指导药物设计和结构优化;鉴定活性和反应性代谢产物，是合理评价药物疗效和安全性的基础。在我国，药物代谢研究偏重于稳定代谢产物的鉴定和检测，反应性代谢物研究尚处起步阶段，使得一些在体内能产生反应性代谢中间体的化合物被作为药物开发使用，给患者带来安全隐患。　　本课题以绿原酸（多种中药注射剂的主要活性成分）和法米替尼（新型酪氨酸激酶抑制剂）为对象，利用各种体内外模型，阐明其代谢和生物活化机理及影响因素，对其临床安全使用具有参考意义。　　1.中药注射剂主要活性成分绿原酸的代谢和生物活化机理研究　　近年来，双黄连注射液、双黄连粉针剂、清开灵注射液、茵栀黄注射液和脉络宁注射液等清热解毒类中药注射剂在临床使用过程中，以过敏反应为主的不良反应报告逐年增加。绿原酸(chlorogenicacid，5-caffeolquinicacid，5-CQA)为这些注射剂共有的活性成分，已有多篇文献报道它可引起过敏反应及肝、肾毒性。5-CQA结构中含有邻二酚羟基和α,β-不饱和酮基团，推测它在体内能生成亲电性的反应性中间体，并与生物大分子共价结合，导致过敏反应。本研究的目的是阐明5-CQA的生物活化机理，并探讨疾病和其他代谢途径对其生物活化过程的影响及中药注射剂中另一成份黄芩苷(baicalin，BG)对其体内处置过程的影响。　　5-CQA与加入还原型辅酶2(NADPH)和谷胱甘肽(GSH)的人肝微粒体(HLM)孵化后主要生成2类GSH结合物，M1（主要为M1-1）和M2(M2-1/M2-2)。通过与合成的GSH结合物对照品比对，确定了M1-1为5-CQA苯环2位的GSH结合物，它是由5-CQA氧化生成邻醌中间体后，再与GSH发生1，4-加成而生成;M2-1和M2-2为5-CQA环外7位的GSH结合物，它们是由GSH直接与5-CQA的α,β-不饱和酮发生1,4-加成而生成。M1-1的生成需要细胞色素P450(CYP)酶参与，主要为CYP3A4和CYP2E1;M2-1和M2-2的生成不依赖于NADPH，但胞浆中的谷胱甘肽转移酶(GST)可以加速该过程。　　静脉注射给药后，5-CQA在大鼠体内广泛代谢，主要代谢途径包括甲基化、葡萄糖醛酸和硫酸结合。此外，在胆汁中检测到大量甲基化后的环外GSH结合物，在尿中检测到5-CQA苯环上的N-乙酰半胱氨酸结合物，提示5-CQA在体内存在与体外孵化相似的生物活化过程。　　含5-CQA的中药注射剂在临床上主要用于治疗发热、感冒、上呼吸道感染和心血管疾病等，在这些病人体内通常具有不同程度的炎症或氧化应激，这些疾病有可能会改变5-CQA的代谢和生物活化水平。为了考察疾病状态对5-CQA生物活化过程的影响，首先将5-CQA与过氧化氢异丙苯、GSH、HLM共同孵化，结果M1-1的生成量较加入NADPH的孵化体系提高6倍，表明氧化应激状态下CYP过氧化物酶可以加速邻醌代谢中间体的生成。将5-CQA与含佛多酯（白细胞激活因子）的人白细胞共同孵化，M1-1的生成量较未经激活的人白细胞孵化体系提高4倍，该过程由髓过氧化物酶(MPO)催化，提示体内炎症可以深化5-CQA的生物活化。采用脂多糖诱导的炎症大鼠模型，进一步证明了当体内存在炎症时，5-CQA更容易氧化生成邻醌代谢中间体。　　甲基化是5-CQA在大鼠体内的主要代谢途径，因此进一步考察了甲基化代谢水平对5-CQA生物活化过程的影响。将5-CQA、NADPH、GSH、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)与人肝S9（HLS9）共同孵化，对比未加SAM的孵化体系，M1-1的生成量减少80％;向上述体系中加入儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）抑制剂托卡朋，M1-1的生成量则提高4倍。与正常大鼠相比，5-CQA在托卡朋建立的低COMT活性大鼠体内更易生成邻醌代谢中间体。上述结果均表明在正常机体状态下，邻二酚羟基的甲基化代谢过程可竞争性抑制邻醌中间体的生成，但由于药物-药物相互作用、疾病和个体差异等因素导致COMT活性降低时，5-CQA的代谢活化水平会显著提高，而增加不良反应的发生风险。　　与5-CQA单体给药相比，给予含5-CQA中药注射剂中常见的另一个活性成份BG可使5-CQA在大鼠体内暴露量(AUC)显著增加，清除率(CL)显著降低，且AUC和CL改变的程度与BG的剂量有关，BG的剂量从40mg·kg-1上升至187mg·kg-1时，AUC增加比例从10.5升至97.1％，CL降低比例从10.0至48.2％。表明BG会影响5-CQA的体内处置过程。为了探明可能的机制，首先考察了同时给予187mg·kg-1BG对5-CQA在大鼠体内的代谢、排泄和组织分布的影响。结果表明共同给药后，体循环中代谢产物的暴露水平大幅下降;原形和代谢产物在尿中的总排泄量不变，但原形排泄量增加56.5％，各代谢产物的排泄量有不同程度降低;原形和代谢产物在胆汁中的总排泄量降低43.5％;BG使5-CQA的肺/血浆分配比和肾/血浆分配比分别提高2.0～9.6倍和2.0～2.7倍，使5-CQA的肝/血浆分配比降低73.2～77.5％，所有组织中代谢物的生成量降低。根据上述结果，推测BG可能通过抑制5-CQA肝、肾和肺的代谢或肝摄取过程而改变5-CQA的药动学行为。体外代谢研究表明，BG对5-CQA的甲基化、葡萄糖醛酸和硫酸结合均有明显的抑制作用。利用稳转摄取转运体的HEK293细胞系对5-CQA的转运特性进行研究，结果表明BG可以抑制OATP1B1介导的5-CQA肝摄取过程。因此，推测BG对5-CQA的体内处置过程的影响主要是通过抑制肝、肾和肺的Ⅱ相代谢以及抑制肝摄取而产生。　　此外，BG也会抑制GST的活性，对MPO的活性无影响，当炎症患者注射同时含有5-CQA与BG的中药注射剂时，在5-CQA体内暴露量增加的同时，其邻醌中间体的生成量以及α,β-不饱和酮的暴露量也会大幅提高，而加大毒性风险。　　2.新型酪氨酸激酶抑制剂法米替尼的代谢和生物活化机理研究　　法米替尼为江苏恒瑞医药有限公司开发的新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂，它是国外已上市药物舒尼替尼的结构类似物，为“me-better”候选药物，目前处于临床Ⅱ期开发阶段。这两种药物在临床使用中均有肝毒性的报道。本研究的目的在于阐明法米替尼在肿瘤患者体内的代谢和生物活化机制，探讨反应性代谢产物生成与肝毒性的关系。　　口服给药后，法米替尼口服吸收良好，消除缓慢，主要以代谢物的形式从粪中排泄。主要的代谢途径包括N-去乙基(M3)、氧化脱胺(M1)、氧化脱氟(M7)、5-氟吲哚酮羟基化(M9-1和M9-5)和Ⅱ相结合。体循环中主要药物相关物质为原形，其次为N-去乙基法米替尼(M3)，稳态时后者的AUC不足原形的7.5％。体外研究表明多种酶参与法米替尼氧化代谢，其中N-去乙基主要由CYP3A4/5催化，氧化脱胺及进一步羧酸化由CYP3A4/5和醛脱氢酶催化，5-氟吲哚酮羟基化和氧化脱氟由CYP1A1/2催化。　　在人体内检测到少量半胱氨酸结合物，提示法米替尼在体内可经代谢活化产生反应性代谢物。通过体外代谢实验，证明了该反应性代谢产物为醌亚胺，但该中间体并非由M7氧化而来，而需要5-氟吲哚酮基团在CYP1A1/2介导下首先发生环氧化，由于对位氨基上孤对电子的给电子效应，使得环氧中间体不稳定，脱氟重排生成醌亚胺反应性中间体。利用人原代肝细胞实验进一步证明了法米替尼对人原代肝细胞具有毒性，且非特异性CYP抑制剂1-氨基苯并三唑和CYP1A1/2抑制剂α-萘黄酮可以显著降低法米替尼对肝细胞的毒性，因此推测法米替尼临床上观察到的肝毒性与其生物活化过程有关。此外，通过对比法米替尼在吸烟者和非吸烟者肺微粒体中的代谢，发现法米替尼在吸烟者的肺微粒体中具有更高的生物活化水平。　　本研究阐明了法米替尼的代谢和生物活化过程，并证明了CYP3A4/5和CYP1A1/2主要参与其体内清除。法米替尼在CYP1A1/2的催化下可生成醌亚胺代谢中间体，从而产生肝毒性，因此当与CYP1A1/2的诱导剂同服时，应关注潜在的毒性反应。此外，吸烟可诱导受试者体内CYP1A1的活性，也应警惕法米替尼在这类人群中使用时的安全性问题。　　3.结论　　本论文以多种中药注射剂的活性成分5-CQA和新型酪氨酸激酶抑制剂法米替尼为研究对象，揭示了其代谢和生物活化机制及影响因素。　　本研究证明了5-CQA结构中的邻二酚羟基可以在体内CYP单氧化酶系（主要为CYP3A4和2E1）和过氧化物酶系(CYP过氧化物酶和MPO)的催化下形成强亲电性的邻醌代谢中间体，病人不同的机体状态（氧化、炎症或低COMT活性）均会改变其生物活化水平。5-CQA自身的α,β-不饱和酮基团也具有很高的亲电活性，而GST可有效降低该基团的反应性。中药注射剂中的另一成份BG会通过抑制5-CQA在肝、肾和肺中的代谢及肝摄取过程，提高后者的体内暴露量。但它也会抑制GST的活性，而不影响MPO的活性。因此，炎症患者给予含5-CQA和BG的中药注射剂时，由于体内5-CQA暴露量的增加，可能导致邻醌中间体生成量的提高以及α,β-不饱和酮与生物大分子共价结合概率的增加，从而使患者面临更高的不良反应发生风险。　　本研究也证明了法米替尼结构中的5-氟吲哚酮在CYP1A1/2介导下可以环氧化并脱氟生成醌亚胺中间体，该生物活化过程与其肝毒性相关。吸烟可诱导CYP1A1的表达而使法米替尼具有更高的生物活化水平。因此应警惕法米替尼与CYP1A1/2的诱导剂同服时或在吸烟人群中使用时，由于提高法米替尼体内生物活化水平，而导致毒性反应增加。　　本论文结果提示在进行药物生物活化研究时，应充分考虑机体自身酶活性水平、竞争性代谢途径、疾病进程、同服药物和吸烟等因素对生物活化过程的影响。本研究为中药注射剂安全性再评价提供了新的研究思路，也有利于指导创新药物的临床合理用药，提高新药研发质量。