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背景FBXW7(F-box and WD-40 domain protein 7)是 SCF(SKP1-Cullin1-F-box protein)E3泛素连接酶复合物中负责识别和结合底物的蛋白成分。它是目前研究得比较广泛的几个F-box蛋白之一。FBXW7通过调控其底物降解过程而参与细胞存活、增殖、分化、迁移等多种细胞生理活动。而由FBXW7负责泛素化降解的底物绝大多数为促癌蛋白,例如c-MYC、Notch1、Cyclin E、c-JUN和MCL-1等。FBXW7基因位于染色体4q32,FBXW7的基因突变及其染色体区域删除或丢失的现象广泛存在于人类癌症中。FBXW7缺失或突变导致其功能失活后,其下游底物促癌蛋白大量积累,最终加速肿瘤的发生发展进程。已有大量研究证实,FBXW7的表达水平变化与癌症的发生发展和患者的生存预后密切相关。LSD1(Lysine-specific demethylase 1)是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶,它属于黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型胺氧化酶超家族。LSD1通过氧化还原反应特异性地催化单甲基化或双甲基化的组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)和第9位赖氨酸(H3K9)发生去甲基化。通过改变H3K4/H3K9的甲基化水平,LSD1发挥着重要的转录调控功能,在多种生理活动过程中发挥极其重要的作用,包括细胞增殖、凋亡、染色体分离、干细胞多能性调控和胚胎发育等。目的LSD1被认为是一个促癌基因,目前针对LSD1的研究及其抑制剂的开发主要基于其去甲基化酶活性。关于LSD1去甲基化酶活性以外的功能,尚不清楚。同样的,FBXW7的研究主要集中在寻找其调控的下游底物方面,而FBXW7上游自身的被调控机制研究不多。我们的研究旨在阐述LSD1是如何通过其去甲基化酶活性非依赖性的途径在上游调控FBXW7的分子机制。以期在转化医学意义上,可以通过阻断FBXW7与LSD1的相互结合来提供一个靶向LSD1小分子抑制剂开发的新思路。方法分别用免疫印迹(WB,Western Blotting)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR,Quantitative Real-time PCR)方法检测LSD1过表达或者敲减对FBXW7的蛋白质和信使RNA(mRNA)表达水平的影响,以此确定LSD1在翻译后水平调控FBXW7的蛋白质表达。用免疫共沉淀(Co-IP,Co-immunoprecipitation)和体外蛋白质相互作用实验(Pull down)明确FBXW7和LSD1存在直接相互作用。用蛋白质半衰期实验以及细胞内泛素化实验证明FBXW7不影响LSD1的蛋白质稳定性,反过来LSD1调控FBXW7的蛋白质自身泛素化进而影响其蛋白质稳定性。采用体内外蛋白质二聚体形成实验证实LSD 1调控FBXW7的机制是通过打断FBXW7的二聚体形成而促进其自身泛素化降解。构建FBXW7的二聚体形成关键位点突变体,以及LSD 1的CPD降解决定子突变体,阐明LSD 1调控FBXW7依赖于二者的相互结合,而不依赖于LSD1的去甲基化酶活性。用Co-IP以及蛋白酶体抑制剂(MG132)和溶酶体抑制剂氯喹(CQ,Chloroquine)处理等方式证实泛素化的FBXW7可以与p62结合并通过p62介导的自噬溶酶体途径降解。在生物功能学的实验上,采用ATPlite、克隆形成实验、微离子辐射镭射光束实验、线性化质粒NHEJ修复实验和离子辐射增敏试验等,检测LSD1是否调节FBXW7的生物学功能。结果我们的论文主要揭示了 LSD1可以直接与FBXW7结合,并且通过其去甲基化酶活性非依赖性的途径负性调控FBXW7的稳定性。具体生化机制上,LSD1是一个FBXW7的假底物,并且FBXW7与LSD1的相互结合不催化LSD1的泛素化,反过来LSD1通过打断FBXW7的二聚体形成而促进FBXW7的自身泛素化。FBXW7发生自身泛素化之后,除了通过蛋白酶体降解之外,还可以通过p62/SQSTM1介导的自噬溶酶体途径被降解。生物功能上,LSD1通过负性调控FBXW7的稳定性而抑制其在细胞增殖、NHEJ修复和离子辐射保护等方面的作用。结论LSD1可以作为一个FBXW7的假底物,直接结合FBXW7而通过其去甲基化酶活性非依赖性途径负性调控FBXW7的蛋白质稳定性。我们的研究揭示了 LSD1之前未知的去甲基化酶活性之外的功能,且很有可能这个功能与其促癌功能有关。在LSD1相关的抗肿瘤药物开发机制上,除了靶向其去甲基化酶活性,我们的研究提示,通过靶向LSD1蛋白本身可能成为一个新的策略。