论文部分内容阅读
类胡萝卜素是一类具有多种生理功能的天然色素,具有极强的抗氧化能力,广泛应用于食品、保健品、医药等领域,市场需求量非常大。三孢布拉霉（Blakeslea trispora）生长迅速,类胡萝卜素含量高,是目前唯一已应用于工业化生产的微生物。但对该菌合成类胡萝卜素的调控机制尚缺乏认识,阻碍了类胡萝卜素合成水平的进一步提高。crgA是在卷枝毛霉（Mucor circinelloides）中发现的一个负调控基因,能够抑制类胡萝卜素的过量积累。三孢布拉霉与卷枝毛霉具有相近的系统分类地位,因此推测crgA在三孢布拉霉中可能存在类似的调控作用,本文基于上述假设进行了crgA调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素的作用分析,以期为提高三孢布拉霉的类胡萝卜素合成水平奠定理论基础。本文以类胡萝卜素的主要合成者三孢布拉霉负菌为研究对象,首先克隆到了crgA基因,然后利用split-marker法对该基因进行敲除获得?crgA菌,并对?crgA菌进行基因回补。分析了三孢布拉霉野生菌、?crgA菌和C-?crgA菌产孢能力、类胡萝卜素结构基因转录水平、关键酶酶活、产物代谢水平的差异,以确定crgA对三孢布拉霉合成类胡萝卜素的调控作用。结果表明,敲除crgA后,三孢布拉霉的产孢能力显著下降,而将该基因重新导入到?crgA菌中,产孢能力恢复到野生型,表明crgA参与调控孢子的形成。本文分析了三种菌hmgR、carRA和car B在不同时间的转录水平。?crgA菌中hmgR、car RA和car B转录水平较野生菌分别最大提高了1.2、1.3和1.6倍,将crgA重新导入后,结构基因的转录则受到明显抑制。在酶活水平上,?crgA菌中HMG-CoA还原酶比活较野生菌最大提高了114.2%;三孢布拉霉菌丝体内和发酵液中抗氧化酶（Catalase,CAT;Superoxide dismutase,SOD;Peroxidase,POD）比活较大的提高。在类胡萝卜素合成水平方面,在发酵前36 h,番茄红素迅速积累,之后逐步转化为β-胡萝卜素,而?crgA菌的合成和转化速度明显高于野生菌。至发酵120 h时,?crgA菌中β-胡萝卜素含量达到46.39 mg?L-1,较野生菌提高了31.2%。在代谢水平上,采用GC-MS技术对三孢布拉霉野生菌和?crgA菌在不同培养时间的代谢物进行了分析,得到代谢物谱,并进行了聚类分析。结果表明野生菌和?crgA菌存在显著差异。?crgA菌代谢物中糖类物质和氨基酸含量明显低于野生菌,而类胡萝卜素、脂肪酸和醇类物质含量则明显高于野生菌。由上述结果可知,crgA是三孢布拉霉的一个负调控因子。基于多元统计模型中的主成分分析,筛选出了5个潜在的生物标记物:肌醇、棕榈酸、塔格糖、单硬脂酸甘油酯和苯,并以?crgA菌为出发菌株对肌醇进行了验证。向培养基中添加不同浓度的肌醇,生物量和β-胡萝卜素含量分别最大提高了18.3%和20.1%,表明肌醇在三孢布拉霉合成类胡萝卜素过程中起到积极的作用。此外,本文初步探究了光照对三孢布拉霉的调控作用,将野生菌和?crgA菌分别在光照和避光的条件下培养。在避光培养时,所有菌株不产生孢子,而β-胡萝卜素含量显著提高,表明光能够刺激孢子的生成但会抑制类胡萝卜素的合成。同时本文分析了乙酸钠对三孢布拉霉的影响,当乙酸钠浓度为2 g?L-1时,β-胡萝卜素含量提高了20.0%。