蛹拟青霉(Paecilomyces militaris)中抗肿瘤活性物质的研究

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本文是在本实验室大规模主要虫生真菌药物模型筛选的基础上,对本实验室保存的菌株蛹拟青霉[Paecilomyces militaris (Kob.) Brown & Smith ex Liang] RCEF0718的抗肿瘤活性进行了进一步的研究。内容包括:菌株最佳发酵时间的确定;活性产物的分离提取;活性产物的纯化工艺;纯化样品的结构测定;纯化后样品对肿瘤细胞的抑制活性。 利用薄层层析扫描,根据菌株在不同时间发酵液中所含的酯相及水溶相样品的含量变化来确定其最佳发酵时间。实验结果表明,10d为该菌株次生代谢产物达到最大值时所需最短时间,故确定10d为最佳发酵时间。 实验确定了该菌株酯相样品的分离纯化工艺流程为: 不同萃取体积比以及不同萃取次数对酯相产量的影响实验表明:乙酸乙酯与发酵液体积比为2:1时萃取效果最佳;在乙酸乙酯与发酵液以体积比为2:1的体积比进行萃取时,分两次萃取会明显增大酯相的产量。 在对酯相进行初步的分离纯化研究中发现,硅胶可以作为一种良好的柱层析固定相;薄层析的研究结果表明:酯相在B#展开剂(即三氯甲烷:甲醇:水=40:10:1体积比)中各斑点分离效果最佳,而E#展开剂(即三氯甲烷:甲醇:水=13:7:1体积比)则为水相最佳展开剂。因此分别取同样极性配比的溶液作为酯相和水相的柱层析洗脱液。 凝胶Sephadex LH—20为固定相,100%甲醇为洗脱液时对酯相样品纯化效果较好,高效液相(HPLC)及薄层析(TLC)实验结果表明:酯相分离纯化后样品Z1-3中仍有两主要组分,不便作进一步深入研究,而Z1-4、Z2-1及Z2-2均为纯度较高样品,纯度均在95%以上。其中Z2-1及Z2-2相同浓度时在254nm紫外灯下吸光值比Z1-4更大。通过Z相粗组分的高效液相色谱分析可以看出,Z2-1及Z2-2为Z相主要组分,通过Z2-1及Z2-2纯样品标准曲线计算,它们共占Z相总质量的80.64%。 纯样品的质谱(MS)和核磁共振(NMR)分析显示,纯化后样品Z2-1及Z2-2为两种结构类似物质,此前均未见报道,为两种新化合物。从结构式判断均为异黄酮类物质。其中 ZZJ的分子式为 C22H22O9,其全称为 4’一羟基异黄酮一7—O一 p—4”甲氧基葡萄糖贰;ZZ上的分子式为C22H22OIm其全称为5,4’一H羟基异黄酮一7—O一P一个’甲氧基葡萄糖贰。 纯化后样品的抗肿瘤实验研究结果表明,与对照组比较,Z及 ZI -4组分在 100 pp/ml、20 u p/ml,ZI-3、ZZ-1、ZZ-2组分在 100 u p砌l时对 HepGz细胞株的抑制率在1%水平是显著的,Z在 4 u g/ml,ZI-3、ZZ-l在 20 n s/ml及 4 u s/ml浓度时对 HapGZ细胞株的抑制率在5%水平显著。Z相组分纯化后的所有纯组分对肿瘤细胞的抑制率均不如Z相高,说明其对肿瘤细胞的抑制作用可能是因为几个组分共同起作用的结果。与对照组比较,Z、Z13、ZI-4、ZZ-1在 100 u g加l时,213组分在 20 u m加 及 ZZ-2在 4 n g/ml浓度时对正常肝细胞株的抑制率在 5%水平是显著的,但很明显,Z相及其纯化后的所有组分对正常肝细胞株的抑制率均明显低于其对于肝肿瘤细胞株的抑制率。
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