论文部分内容阅读
目的：头颈鳞癌（Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）作为临床上常见的恶性肿瘤，其发病率近年来呈逐渐上升趋势。现有的局部手术切除及放化疗综合治疗中，患者治疗效果及5年生存率仍然不高。急需在HNSCC发生发展及治疗敏感性理论研究领域取得突破性进展，以期为HNSCC患者的化疗和基因治疗提供实验依据和理论基础。本实验在前期短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）技术靶向沉默FANCD2的基础上，观察其对人HNSCC SIHN-005A细胞体外增殖、凋亡和细胞周期以及化疗敏感性的影响，并对FANCD2shRNA干扰影响化疗敏感性的机制进行初步研究，探讨FANCD2用于HNSCC研究和治疗的可行性，以期为增强人HNSCC化疗敏感性以及提高化疗疗效探索新的方法，并对FA通路与头颈肿瘤化疗的联系及可行性进行展望。方法：（1）将前期试验获得SIHN-005A细胞分为shRNA实验组（FANCD2shRNA）、无效序列对照组（FANCD2shRNA-C）以及空白（未转染）对照组（Control），复苏并传代培养上述细胞，通过Western Blot检测FANCD2蛋白沉默情况，并计算沉默效率；（2）通过细胞增殖抑制试验（CCK-8法）检测各组细胞在不同时间OD值，计算抑制率并绘制细胞生长抑制曲线；（3）Hoechst荧光染色法检测各组细胞凋亡情况并观察细胞凋亡形态，比较FANCD2shRNA沉默对SIHN-005A细胞凋亡的影响；（4）Western Blot蛋白印迹法检测细胞周期D1蛋白（Cyclin D1），比较FANCD2沉默对SIHN-005A细胞细胞周期的影响；（5）CCK-8及Hoechst染色法比较各组细胞在加用DNA交联剂顺铂（Cis-diamminedichloroplatinum，CDDP）干预后增殖、凋亡变化，WestermBlot蛋白印迹法检测FANCD2shRNA沉默Cyclin D1蛋白表达变化，比较FANCD2shRNA沉默对SIHN-005A细胞化疗敏感性的影响；（6）WestermBlot蛋白印迹法检测三组细胞未干预和加用CDDP后Bax，Bcl-2和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达变化情况，并讨论shRNA干扰沉默FNACD2表达影响化疗敏感性的可能机制。结果：（1）实验组SIHN-005A细胞经shRNA干扰有效沉默FANCD2后蛋白表达灰度值（0.53±0.09）较之无效序列对照组（1.15±0.11）（F=78.823，P <0.05）和空白对照组（1.34±0.07）（F=104.113，P <0.05）明显下降，沉默效率达60.5%；（2）三组细胞培养并连续观察72小时，SIHN-005AFANCD2-shRNA细胞组增殖情况不及其余各组细胞，其抑制率随时间的延长而增高，分别与空白对照组（F=48.647，P<0.05）及无效序列对照组（F=22.768，P<0.05）比较差异有统计学意义；（3）Hoechst染色结果示实验组细胞凋亡率（13.19±1.38）%高于无效序列对照组（2.22±2.01）%及空白对照组（1.18±0.05)%，SIHN-005AFANCD2-shRNA实验组与无效序列对照组（F=35.732, P<0.05）及空白对照组（F=42.387,P<0.05）相比凋亡率差异有统计学意义；（4）应用Western Blot蛋白印迹法检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达水平，计算灰度值发现FANCD2-shRNA实验组中的表达水平（0.73±0.11）较无效序列对照组（0.96±0.14）和空白对照组（1.04±0.07）明显下调，实验组与无效序列对照组（F=8.317，P<0.05）和空白对照组（F=10.759，P <0.05）比较差异有统计学意义；（5）加入不同浓度CDDP后，CCK-8法检测结果提示，各组SIHN-005A细胞OD值随CDDP浓度的升高而降低（F=48.647，P<0.05），抑制率则随CDDP浓度的升高而增高（F=29.703, P<0.05），其中shRNA实验组的OD值较无效序列对照组（F=78.642，P<0.05）和空白对照组（F=82.521，P<0.05）明显降低，实验组抑制率则较无效序列组（F=43.381，P<0.05）和空白对照组（F=67.928，P<0.05）明显增高；16μg/ml CDDP作用于各组细胞后，其OD值（F=91.026, P<0.05）与抑制率（F=77.301, P<0.05）随时间增加而增高，其中shRNA实验组OD值明显低于无效序列组（F=47.384,P<0.05）和空白对照组（F=57.275，P<0.05），实验组抑制率则明显高于无效序列组（F=56.464，P<0.05）和空白对照组（F=69.022，P<0.05），shRNA实验组SIHN-005A细胞对CDDP的IC50值11.5±0.35μg/ml，明显低于无效序列对照组18.4±1.11μg/ml （F=46.324, P<0.05）和未转染对照组19.9±1.42μg/ml（F=77.722, P<0.05）；16μg/ml CDDP作用48h后，Hoechst染色结果示shRNA实验组细胞凋亡率（85.12±2.03）%高于无效序列对照组（17.87±1.63）%（F=383.812, P <0.05）及空白对照组（11.94±2.42）%（F=454.839, P <0.05），Western-Blot蛋白印迹法结果显示shRNA实验组cyclin D1灰度值（0.55±0.09）较无效序列对照组（0.89±0.18）（F=22.482,P<0.05）和空白对照组（0.97±0.24）（F=27.449, P<0.05）明显降低，且加入CDDP后实验组cyclin D1灰度值（0.55±0.09）低于未加CDDP实验组灰度值（0.73±0.11）（F=19.867, P<0.05），即加用CDDP的shRNA实验组细胞细胞周期阻滞效应较未加CDDP实验组更加明显；（6）Western-Blot蛋白印迹法检测各组细胞在未加和加用CDDP后Bax，Bcl-2，HIF-1α等相关蛋白的表达水平。结果显示：加用CDDP后，Bax蛋白在shRNA实验组中的表达（2.78±0.17）较无效序列对照组（0.93±0.22）（F=193.272, P<0.05）及空白对照组（0.89±0.16）（F=211.736, P<0.05）明显增强，Bax表达在加入CDDP后的实验组（2.78±0.17）与未加CDDP的实验组（1.69±0.24）比较差异也有统计学意义（F=98.744, P<0.05）；Bcl-2蛋白加用CDDP后在shRNA实验组中的表达（0.21±0.07）较无效序列对照组（0.54±0.07）（F=117.452,P<0.05）及空白对照组（0.79±0.21）（F=139.229, P<0.05）明显下调，Bcl-2的表达在加入CDDP后实验组（0.21±0.07）与未加CDDP实验组（0.63±0.06）的比较中差异也有统计学意义（F=144.738, P<0.05）；检测HIF-1α蛋白，加用CDDP后shRNA实验组中的表达（0.60±0.29）较无效序列对照组（1.25±0.56）（F=93.733, P<0.05）及空白对照组（1.39±0.22）（F=105.832,P<0.05）明显下调，同时，HIF-1α表达在加入CDDP后实验组（0.60±0.29）与未加CDDP实验组（1.13±0.32）的比较中差异也有统计学意义（F=187.454,P<0.05）。结论：（1）通过shRNA干扰技术能够稳定沉默人HNSCCSIHN-005A细胞FANCD2表达；（2）经shRNA干扰靶向沉默FANCD2蛋白表达能抑制人HNSCC SIHN-005A细胞增殖、加速和促进细胞凋亡、阻滞细胞周期于G1/S期，即引起SIHN-005A细胞的生物学功能改变；（3）在DNA交联剂干预情况下，人HNSCC SIHN-005A FANCD2-shRNA细胞在细胞体外生长抑制及化疗药物增敏上均有显著影响，表现在更为明显的抑制细胞增殖、促进凋亡和细胞周期阻滞上，即shRNA干扰沉默FNACD2表达能提高HNSCC SIHN-005A细胞对DNA交联剂CDDP的敏感性。（4）shRNA沉默FANCD2表达后可能通过下调cyclin D1和HIF-1α，提高Bax/Bcl-2比值等方式共同作用影响SIHN-005A细胞体外生长及化疗敏感性变化。（5）FANCD2有望成为HNSCC研究和治疗中新的靶点和研究目标，而shRNA稳定转染目的基因的技术也可以为肿瘤的基因治疗提供更好的理论支持和技术平台。