研究背景和目的：心血管疾病是当今世界威胁人类生命的主要杀手之一。随着科学研究的深入,人们发现维持心肌细胞的生长和死亡的平衡是决定心血管病人的心脏功能是否健全的重要因素。因此,针对这种与细胞及组织器官衰老密切相关所导致的疾病的根本原因采取方法及应变之道已成为药物学研究的重点与方向。能量限制(Calorie Restriction, CR)即低于或限制随意饮食摄取,但又不至于引起营养不良的一种食物摄入量的限制可使生物的寿命延长早已见诸于许多科学界研究过的相关生物主题如酵母菌、线虫、果蝇和鼠类等。CR对灵长类动物寿命延长的相关研究也正在进行中,并已经获得初步肯定的结果。CR在延缓或部分或完全可以预防与年龄或老化导致的有关疾病如心血管疾病、各种癌症、神经退化性疾病和糖尿病等方面的研究得到越来越多的重视。许多实验证实短期的CR也能降低人类冠心病和中风的发生。相关基因的研究显示,CR延长寿命的效应是由沉默信息调节因子2(Silent information regulator 2, Sir2)调节的,它是在酵母菌的研究中首次被发现的。Sir2是一个氧化的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD+)依赖的组蛋白脱乙酰基酶,在多种细胞生理作用与反应中发挥作用,包括基因沉默、rDNA重组、CR诱导的寿命延长和DNA修复等等。哺乳类动物有7个Sir2的同源基因,命名为Sirtuins,即SIRT1-7。SIRT1与酵母Sir2的同源性最高,迄今为止已被广泛研究。已发现SIRT1蛋白参与脂肪组织、肝脏和肌肉组织的代谢调控,它可调节这些组织中的核受体过氧化酶体增殖子启动受体γ(nuclear receptor Peroxisome-Proliferator Activated Receptor-γ, PPARγ)和其转录共启动子PGC-1α。SIRT1的非组蛋白底物还有肿瘤抑制因子p53、FOXO转录因子和核因子NF-κB等,通过这些靶分子参与细胞的存活、繁殖和应激应变等调节过程。SIRT1也可藉由使DNA修复因子Ku70去乙酰化调节细胞的凋亡。在心脏中,SIRT1可通过使p53和FOXO1去乙酰化作用调控心脏的发育,抵抗应变和衰老相关性心肌功能紊乱。SIRTs也可通过调节内皮一氧化氮合酶(endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS)、FOXO1、p53和血管紧张素II的I型受体(AngiotensinⅡType 1 Receptor, AT1R)表达及活性,促进血管内皮和平滑肌细胞的舒张和再生功能。近期研究发现SIRT7也是一个心脏组织稳定的基本调节因子。SIRT7基因缺失小鼠的平均寿命和最大寿命均缩短,出现心脏扩大和心肌炎等病变。SIRT7基因缺失小鼠的原代心肌细胞基础凋亡率增加约200%,抗氧化应变和基因毒应变能力显着下降。这些结果提示SIRT7在心脏氧化应变和细胞死亡的调节中发挥关键作用。对于其它SIRTs成员,如SIRT2、3、5可能与SIRT1相似,也具有NAD依赖性脱乙酰基酶活性,而SIRT4和SIRT6是ADP核糖基转移酶。它们在心脏的功能上所扮演的角色目前尚不明确,也是本研究欲探讨的重点之一本研究的目的之一就是观察心肌细胞的7个SIRTs成员在受氧化应变刺激时的表达与变化,进而分析出是否每一个SIRTs的成员都在其中发挥作用；另外,观察白藜芦醇是否可作为所有SIRTs蛋白的启动剂而促进其表达,进而与SIRT1一样发挥其对心肌细胞抗氧化应变的保护作用。本研究通过充分观察与实验以确认其在受氧化应变刺激时的表达与变化,并观察其与SIRTs间的交互作用及其产生的结果。白藜芦醇(Resveratrol又名葡萄红醇),是一种多酚类化合物,别名”虎杖甙元”,化学为”Trans-3-4’-trihydroxystilbene,分子式为：C14H1203,分子量为：228.25白藜芦醇可被视为植物的抗毒素(Phytoalexin),当植物受到环境压力、各种细菌感染时,就会产生抗毒素来对抗外来细菌的侵袭。目前已知白藜芦醇有抗病、抗癌与延缓老化的功效,它也是植物性雌激素(Estrogen),具有改善妇女更年期与更年期前征候群征状的功效。此外它更具备下述功能与效果：清除自由基,抗氧化,抗炎症,预防基因突变,预防恶性肿瘤发生并抑制肿瘤生长,防止低度密脂蛋白氧化,心血管保护剂能预防慢性缺血心脏病并减少心肌梗塞和缺血再灌注造成的伤害,帮助血管舒张,血压稳定,促进一氧化氮生成,抑制血小板不正常凝结和血清素(Serotonin)的分泌,具有保护神经系统功效,稳定情绪及改善忧郁症,失眠等征状,促进胶原蛋白合成,减少骨质疏松的机率并促进新骨形成。除此之外越来越多的研究显示,白黎芦醇对于一些老化疾病,诸如老年痴呆、糖尿病等,有明确效果或者症状改善。白藜芦醇的抗老化效果类似能量限制法(Calorie Restriction,CR):能量限制(Calorie Restriction,CR)意即减少对卡路里的摄取,科学界目前有许多广泛研究,并证实在许多动物实验中,以能量限制的方法,可以延长实验动物平均寿命约60%。虽然科学家尚未完全断定“能量限制”是否也可以延长人类的寿命,但后续研究的实验显示其结果非常类似动物实验。对于人类,低卡路里饮食与一些导致长寿的可能与潜在因素有关。能量限制可以降低血液中胰岛素的浓度,人体基础代谢率(BMI)也降低,能量限制会减慢细胞老化的速度与程度并减缓染色体的损害。当然,能量限制也可以减少因为肥胖所引起的疾病,如新陈代谢征候羣等相关疾病。近来白藜芦醇保护各种器官(肾脏,心脏与脑部)免于缺血后再灌注损伤(Ischemic reperfusion injury)及其抗癌效果逐渐被发现与重视。截至目前的研究成果已可证明,在保护人体健康方面,白藜芦醇具备以下主要功能：抗肿瘤,促使Myeloid leukemia细胞凋亡(Apoptosis),抗衰老,防止LDL氧化,具神经保护作用,减少血小板及单核球沾黏,具备抗发炎反应能力,保护肺脏免于遭受DNA伤害及其造成的细胞凋亡等。Resveratrol的保护作用主要机理有：(1).做为细胞外抗氧化齐(?)(Intracellular antioxidant);(2).做为抗炎剂(Anti-inflammatory agent);(3).促成氮氧合成酶(Nitric Oxide Synthesis(NOS))表达；(4).促进血管新生作用(Angiogenesis);(5).促进神经元细胞增生；(6).增加腺粒体(Mitochondria)活性。Resveratrol可以清除细胞内ROS(自由基),Resveratrol也可清除超氧负离子(Superoxide anion)。在缺血灌注的器官如心脏,脑部,肾脏等,Resveratrol均能经由诱导一氧化氮合成进而降低氧化压力(Oxidative stress),一氧化氮由于具有未配对电子,所以能以接近扩散限制的速率(diffusion-limited rate:6.7×102M-1s-1)快速地在缺血而重新灌注的器官与02结合并将其排除,NO与O2结合的速度远快于SOD(Superoxide dismutase)与O2结合的速度,如此间接说明了在缺血器官再灌注时,如何避免O：对组织器官的伤害时Resveratrol所扮演的角色。Resveratrol亦限制12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)在HL-60细胞群培养之中的自由基产出。Resveratrol会抑制摄护腺癌DU 145细胞的增生,DU 145细胞群亦会减少NO及促一氧化氮合成酶(inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS))的产出。Resveratrol亦会限制Lipopolysaccharide (LPS)或TPA刺激巨噬细胞所产生的H2O2及O2。Resveretrol同时亦限制肿瘤坏死因数(TNF)所诱导许多细胞的氧化反应中间产物(Reactive oxygen intermediates)的产出及酯质氧化反应(Lipid peroxidation)的形成。Resveratrol同时亦清除泛氧自由基(Peroxyl radicals)及氢氧自由基(Hydroxyl radicals)在缺血后心肌再灌注的产出,且因此降低Malonaldehyde(一种可推测之酯质氧化反应标识物)。Resveratrol可以维持细胞内抗氧化物浓度,亦可以在氧化压力下保持麸胱甘肽(Glutathione)在周边血及淋巴球内的浓度,同时在TPA媒介的氧化压力反应下,Reseveratrol可以再储存Glutathione。而且Resveratrol在人体淋巴球内亦可增进数种抗氧化酶的数量,如：Glutathione Peroxidase,Glutathione-S-transferase, Glutathione reductase等。白藜芦醇是否可作为所有SIRTs蛋白的启动剂而促进其表达,进而与SIRT1一样发挥其对心肌细胞抗氧化应变的保护作用则为本研究的另一重点,在本研究的所有实验中将充分观察与验证确认其在受氧化应变刺激时的表达与变化,并观察其与SIRTs之间的交互作用及其产生的结果则为本研究关注的核心问题。研究方法：大鼠心肌细胞株H9c2(10000-12000细胞/cm2)在DMEM培养基中培养48h后分别置入系列稀释浓度的H202(0、10、50、100μM)中,用噻唑蓝(MTT)比色法首先观察H202氧化应变中对细胞活力的影响,选择一个适宜的作用浓度用于以下的氧化应变刺激实验。另外用不同浓度的白藜芦醇(0、10、20、50、100μM)处理细胞,同样观察其对细胞活力的影响,从中选择一个适宜的作用浓度用于观察其对心肌细胞抗氧化应变保护和SIRTs蛋白表达变化等实验。然后再将细胞随机分为3组,①正常对照组：不进行任何处理；②氧化应变组：弃去旧培养液,加入不含血清的DMEM,培养30min后再加入终浓度为50μmol/L H2O2；③20μmol/L白藜芦醇干预组：在加入H2O2前30 min加入20μmol/L白藜芦醇预处理。以上各实验组细胞在37℃条件下继续培养6h后终止。试验各组细胞检测指标及条件均相同。用MTT法测定细胞活性；末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP Nick-End Labeing,TUNEL)技术和流式细胞仪(Flow Cytometry Analysis, FCM) PI染色法分析细胞凋亡；RT-PCR法检测SIRT1-7 mRNA表达水平的变化；Western blot法检测SIRT1-7及p53蛋白表达的变化。结果：1.H9c2细胞分别用10,50和100μM H202处理6h后,用MTT法检测细胞活性。结果表明：各处理组的光密度值均低于正常对照组,与正常对照组比较,50μM组细胞活性显着下降(P<0.05),而100μM组进一步下降(P<0.01)。因此选择50μM作为H202氧化应变刺激的实验浓度。2.为分析不同浓度白藜芦醇对H9c2细胞活性的影响,分别用0、10、20、50、100μM白藜芦醇处理24 h进行MTT检测。结果表明：10μM和20μM处理组光密度值(OD值)均高于对照组,20μM白藜芦醇组作用最显着(P<0.05),50μM组开始下降,低于对照组(P>0.05),100μM组降至最低(P<0.05)。因而选择50μM作为观察心肌细胞抗氧化应变和SIRT表达的作用浓度。3. TUNEL法检测细胞凋亡率在正常对照组细胞为1.56%,氧化应变6h后细胞的凋亡率(16.98%)明显增加(P<0.05),白藜芦醇干预组(8.65%)较氧化应变组明显降低(P<0.05)。FCM法分析Sub-G1百分率结果和TUNEL检测结果一致。正常对照组的细胞未见亚二倍体凋亡峰(Sub-G1=1.04%)；50μtM H202处理6h后,在Go/G1期峰前出现亚二倍体凋亡峰(Sub-G1=8.56%)；而20μM白藜芦醇预处理后亚二倍体凋亡峰减小(Sub-G1=1.98%)。但是,在白藜芦醇预处理前加用Sirtuin抑制剂尼克酰胺(Nicotinamide, Nam)阻断SIRTs的表达后,白藜芦醇的抗凋亡作用被逆转。与白藜芦醇干预组比较,Nam干预组细胞凋亡率(18.23%)及Sub-G1百分率(9.01%)显着升高(P<0.05)。4.依照本研究实验RT-PCR结果显示H9c2细胞用50μtM H2O2处理6h后,SIRT1、3、4、7 mRNA的表达与正常对照组比较明显降低(P<0.05)；SIRT2,5,6 mRNA的表达在三组中没有显着差异。5.依照本研究实验Western blot结果显示SIRT1-7蛋白表达水平的变化与其mRNA表达水平的变化一致。H9c2细胞用50μM H2O2处理6h后,内源性SIRT1、3、4、7的表达与正常对照组比较显着降低(P<0.05)；而20μM白藜芦醇预处理后,SIRT1、3、4、7的表达与氧化应激组比较显着增加(P<0.05)。而SIRT2、5、6的表达在三组中没有显着差异。6. Western blot结果表明p53蛋白在正常对照组表达最低,H2O2处理后它的表达显着增加(P<0.05),而白藜芦醇干预组较氧化应激组明显下降(P<0.05)。结论：1.氧化应变诱导的心肌细胞凋亡可能与SIRT1、3、4、7表达下降相关。2.白藜芦醇能抗H2O2诱导的心肌细胞凋亡可能与其能促进SIRT1、3、4、7表达上调有关。3.白藜芦醇不仅是SIRT1的启动剂,也同时可启动心肌细胞内SIRT3、4、7；在心肌细胞内SIRT2、5、6可能不受白藜芦醇的影响。