一、研究目的韧带等致密结缔组织的严重损伤和缺损不能自愈,需要替代物予以修复重建。现有的替代物来源包括自体肌腱、同种异体肌腱和合成材料,但各种替代物均因各自固有的缺陷。理想的韧带替代材料必须具备良好组织相容性,良好的力学特性,并且在重建的过程中能满足重建器官运动功能的力学要求,最终被宿主重建成自身所需的组织。同时替代材料须具备材料的可塑性,以便满足各种程度缺损的重建要求。牛肌腱纤维束具备上述特点,其主要成分是Ⅰ型胶原蛋白,与韧带细胞外基质成分类似,免疫源性低,具有良好的组织相容性和良好的生物力学性能,并且具有纤维材料的特性,能编织成多种形态和强度的替代物,以满足修复重建的需求。但是制备肌腱胶原纤维束存在诸多难点,主要表现在:1、牛肌腱纤维束分离困难:把新鲜的牛肌腱分离成纤维束非常困难,目前没有相关文献和技术报道;2、脱细胞困难:肌腱的抗原性主要来自胶原纤维束间的肌腱细胞,由于腱内膜和腱膜的层层包绕,现有的脱细胞同时对胶原蛋白造成不同程度的破坏。针对上述难点,该论文的研究目的包括:1、分离牛肌腱纤维束,保留胶原纤维原有的生物学性能;2、脱除肌腱细胞成分,减少对胶原蛋白和胶原纤维结构的影响;3、脱细胞牛肌腱纤维束材料的体外和体内生物相容性的检测;4、脱细胞纤维材料修复重建韧带缺损动物模型以及评价。二、研究方法（一）牛肌腱纤维分离选用成年黄牛四肢的趾伸和趾屈肌腱的中间段作为研究对象。将新鲜牛肌腱冻干（真空,-56℃）后,在常温下用机械方法将牛肌腱分离成牛肌腱纤维束。为了检测冻干和机械分离过程对胶原纤维的影响,设立新鲜牛肌腱组作为对照组,分别通过比较:1.组织学HE染色:胶原纤维的排列序列和紧密度,2.电镜扫描:胶原原纤维的形态,3.胶原蛋白定量,4.生物力学测定最大拉力载荷和弹性模量等方法进行评价,统计方法应用配对t检验,使用SPSS21.0软件计算。（二）牛肌腱纤维束脱细胞方法肌腱细胞的长度20-70μm、宽度8-20μm,脱细胞牛肌腱纤维束的直径50-200μm,附着于胶原纤维束间的肌腱细胞无腱外膜包绕,包绕胶原纤维束的腱内膜结构疏松且完整性在机械分离过程中破坏,无需化学去污剂破坏腱外膜和腱内膜的完整性。冻干牛肌腱纤维束用γ射线（15K Gray）消毒后,按如下步骤脱细胞:10m M tris-0.05%PMSF,24h,25℃+0.05%胰酶5h,25℃+90 U/m L脱氧核糖核酸酶（type II牛）,5 h,37℃,+PBS 48h,-4℃。所有步骤均在无菌、摇床（室温,150RPM）进行,均加5ml/L青霉素/链霉素溶液（10000U/ml 10000mg/ml）溶液预防细菌污染,完成每一步骤均使用灭菌PBS冲洗3遍。脱细胞后与正常肌腱比较,Hoechst荧光染色在脱细胞过程中实时监测DNA成分脱除的效果,HE染色观察细胞核成分脱除和胶原纤维束的排列形态,电镜扫描观察脱细胞胶原原纤维和胶原纤维形态结构;细胞成分残留通过DNA定量检测,胶原蛋白定量检测评价脱细胞对肌腱胶原蛋白的影响。组间生物学特性和生物力学差异使用配对样本t-检验检测,应用SPSS21.0软件计算。（三）脱细胞牛肌腱纤维束异种体外细胞和体内组织相容性体外脱细胞牛肌腱纤维束的异种细胞相容性,选用实验细胞培养用的Ⅰ胶原蛋白（C7661大鼠来源）为对照组,选用SD大鼠鼠尾肌腱细胞分别与脱细胞胶原纤维和Ⅰ胶原蛋白复合培养,电镜观察细胞在脱细胞纤维束上生长的形态,MTT等检测比较细胞生长状态,差异通过重复方差检验分析比较,应用SPSS21.0软件计算。异种体内脱细胞牛肌腱纤维束的组织相容性评价,选用8周的SD大鼠,将脱细胞牛肌腱纤维束和SD大鼠自体肌腱埋入棘突旁肌肉组织内。分别在植入前、术后1、3和6周,通过HE染色观察脱细胞牛肌腱纤维束内部宿主细胞迁移、炎症细胞浸润,以及胶原纤维的排列结构,Masson染色观察内部胶原纤维的情况。（四）脱细胞纤维束修复重建韧带缺损动物模型选取3月的新西兰大白兔作为研究对象,切除一侧兔膝关节前交叉韧带,将脱细胞牛肌腱纤维束捻合成直径2mm的前交叉韧带替代物,进行兔膝关节前交叉韧带重建。术后6周观察关节内的炎症反应,行膝关节股骨远端、胫骨近端CT检查,观察替代物穿行的骨隧道变化;关节硬组织切片观察骨通道-韧带替代物界面愈合的情况三、结果（一）冻干牛肌腱纤维束新鲜肌腱冻干前后,重量前后比例5:2。机械分离获得的冻干肌腱纤维化束,扫描电镜检测,纤维束的直径为50-200μm,长度20-80mm。两组HE染色检测见胶原纤维形态无差别,但胶原纤维束间隙冻干牛肌腱纤维束组要大于新鲜肌腱组;扫描电镜下观察冻干胶原原纤维结构无破坏,同新鲜肌腱组。相同干重的冻干牛肌腱纤维束和新鲜肌腱的胶原蛋白定量、生物力学测定的最大拉力载荷和弹性模量均无统计学差异。（二）脱细胞牛肌腱纤维束牛肌腱纤维束经胰酶、DNA裂解酶和反复漂洗等方法能有效脱除牛肌腱纤维束细胞,脱细胞过程中可以用Hoechst荧光检测实时观察细胞核脱除程度,HE染色见细胞成分脱除,对纤维排列无影响,扫描电镜检测脱细胞胶原原纤维结构无破坏;与脱细胞前比较,无化学去污剂法能有效清除细胞DNA成分,对胶原蛋白定量无显著影响,生物力学检测见最大拉力载荷和弹性模量差异均无统计学差异。（三）脱细胞牛肌腱纤维束异种体外细胞和体内组织相容性结果体外脱细胞牛肌腱纤维束与SD大鼠肌腱复合培养体在扫描电镜下观察,见纤维束表面细胞生长,MTT等检测见牛肌腱纤维束对SD细胞生长曲线较Ⅰ型胶原蛋白组无明显影响,差异无统计学意义。脱细胞牛肌腱纤维束埋入SD大鼠棘突旁肌肉组织内,HE染色和Masson染色可见:植入后1周,脱细胞胶原纤维周围可见较多炎症细胞浸润,3周可见周围炎症细胞减少,可见成纤维样细胞迁移入脱细胞胶原纤维内,胶原纤维排列规则,较自体肌腱对照组无显著差异,6周后见脱细胞胶原纤维排列规则,内部有较多的成纤维样细胞生长,形态学上类似自体肌腱组。（四）脱细胞牛肌腱纤维束替代物修复重建韧带缺损动物模型结果前交叉韧带重建后1、3和6月行CT检测,检查见骨通道直径重建后3月较1月缩小,术后6月较术后3月无显著变化;重建后6月,关节内滑膜炎症反应不明显,关节面无破坏,硬组织切片见骨通道内脱细胞纤维材料与骨愈合附着界面愈合良好。四、结论（一）新鲜肌腱冻干后可以通过机械松解和精梳的方法分离获得牛肌腱纤维束,直径50-200μm,长度2-8cm。（二）牛肌腱纤维束通过胰酶、脱氧核糖核酸酶和反复冲洗等即刻脱除肌腱细胞,无需加细胞去污剂。（三）脱细胞牛肌腱纤维束具有良好的异种细胞和组织相容性。（四）将脱细胞肌腱纤维编织成韧带替代物,修复重建新西兰大白兔前交叉韧带损伤模型,膝关节面光滑、滑膜炎症反应小,骨通道内脱细胞纤维材料与骨愈合附着界面愈合良好。