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目的 构建人抗HBsAg单链抗体基因,在真核细胞和原核细胞中进行表达,并对其表达产物的活性进行鉴定。 方法 以从噬菌体抗体库中筛选获得的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板,分别扩增出其轻、重链可变区(VL、VH)基因,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly4Ser)3的编码序列连接,并引入前导肽编码序列,构建具有L-VH-Linker-VL结构的单链抗体基因。 将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N3,瞬时转染COS-7细胞,分析其表达情况。稳定转染Jurkat细胞,建立稳定表达ScFv融合蛋白的细胞系,并分析其表达产物的活性。 将获得的不含前导肽的单链抗体基因克隆入HA和6His融合的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL21中进行表达,分析其表达情况。表达产物并经NiNTA柱纯化后,分析其活性。 结果 经测序表明,前导肽、连接肽、V。及V。的序列正确,经酶切鉴定证实成功地构建了绿色荧光蛋白基因融合表达载体。瞬时转染COS刁细胞后,通过荧光显微镜观察、间接免疫荧光检测、免疫组化检测证实了SCFV融合蛋白的表达。稳定转染 Jurkat细胞,经 G4筛选,建立了稳定表达 ScFv融合蛋白的细胞系。建系细胞裂解产物和浓缩的培养上清经SDS-PAGE及Western Blot分析,证实了ScFv融合蛋白的分泌性表达。间接ELISA检测证实所表达的单链抗体具有与HBSAg结合的特异性。建系细胞培养上清与肝癌细胞作用后,经荧光显微镜观察、间接免疫荧光及流式细胞仪检测进一步确定表达的SCFV融合蛋白具有与HBSAg特异性结合的活性。 经酶切鉴定证实原核表达载体pTAT爿ASCFV构建成功。在大肠杆菌BLZI中实现了 SCFV融合蛋白的表达。经 Ni-NTA柱纯化获得纯化产物,经间接ELISA分析确定所得产物具有与HBSAg结合的特异性。与肝癌细胞作用后,通过间接免疫荧光检测、免疫组化捡测进一步确定所获得的纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。 结论 门)成功地构建了五种人抗HBSAg单链抗体基因。Q)瞬时转染COS7细胞,获得了分泌性表达。稳定转染Jurkat细胞,经筛选获得稳定表达SCFV融合蛋白的细胞系,并证实表达产物具有与HBSAg特异性结合的功能。(3)在大肠杆菌 BLZI中进行表达,经 Ni-NTA柱纯化获得了纯化产物,并证实纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。