论文部分内容阅读
嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体，可导致流行、散在和非典型肺炎。嗜肺军团菌是一种兼性胞内寄生菌，广泛存在于各种自然水源及人工管道水源中，污染空调冷凝器、浴室、淋浴喷头等处后，人因吸入含有军团菌的气溶胶而感染，并在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖。嗜肺军团菌侵入肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞与外膜蛋白、Ⅳ型菌毛蛋白等有关。由嗜肺军团菌主要免疫原基因ip编码产生的29kDa外膜蛋白（29 kDa immunogenic protein，IP）在机体防御军团菌感染方面具有重要作用，是机体免疫应答反应的主要免疫原，也是军团菌致病因子，而其具体的机理仍不清楚。军团菌黏附于宿主细胞表面是其致病的先决条件，菌毛是细菌的黏附结构。嗜肺军团菌的pilE基因编码的Ⅳ型菌毛蛋白参与细菌多种功能活动：如黏附、活动力、特异靶细胞的识别及噬菌体的感染等。此外，29kDa外膜蛋白和Ⅳ型菌毛蛋白还是一种重要的保护性抗原。本研究在查阅分析国内外相关文献及结合本室研究进展的基础上，选择ip基因、pilE基因为疫苗候选基因，采用重叠延伸PCR法将嗜肺军团菌ip和pilE基因融合，构建ip基因、pilE基因及ip／pilE融合基因的重组真核表达载体作为DNA疫苗，检测其免疫原性和免疫保护性，为研制嗜肺军团菌DNA疫苗提供一定的实验依据。本研究共分六部分进行：第一部分，以嗜肺军团菌血清1型（L1）菌株基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增出792bp的ip基因，将其定向克隆到原核表达载体pET-32a（+），构建原核表达重组质粒pET-ip，经IPTG诱导有效表达出Trx-IP融合蛋白质。第二部分，采用PCR法从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pilE基因，将其定向克隆入原核表达载体pET-32a（+），构建原核表达重组质粒pET-pilE,并诱导Trx-PILE融合蛋白在原核系统中高效表达。第三部分，采用重叠延伸PCR法将嗜肺军团菌ip和pilE基因融合，融合基因ip／pilE被定向克隆入原核表达载体pET-32a（+）中，构建原核表达重组质粒pET-ip／pilE，经IPTG诱导表达出Trx-IP／PILE融合蛋白。第四部分，将ip基因、pilE基因和ip／pilE融合基因分别克隆入pcDNA3.1（+）中，得到真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip、pcDUA3.1-pilE和pcDNA3.1-ip／pilE。将这三种真核表达重组质粒分别用脂质体介导转染NIH3T3细胞，用免疫荧光法检测各克隆基因蛋白的瞬时表达，随后用Western-blot分别鉴定稳定转染的阳性细胞，均表达出相应大小的蛋白。第五部分，将构建好的真核重组质粒作为DNA疫苗，肌肉注射免疫BALB／c小鼠两次，并设pcDNA3.1（+）、PBS组，检测免疫小鼠体内的抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ、IL-2产生水平、CTL杀伤活性等指标，评价疫苗的免疫原性。结果发现，与空质粒对照组相比，各实验组均检测到不同程度的免疫原性，差异有显著性（P＜0.01）：pcDNA3.1-ip／pilE免疫组抗体的滴度高于pcDNA3.1-pilE免疫组（P＜0.05）；pcDNA3.1-ip／pilE免疫组细胞免疫各项指标均高于pcDNA3.1-ip、pcDNA3.1-pilE免疫组。pcDNA3.1-ip免疫组和pcDNA3.1-pilE免疫组相比，pcDNA3.1-ip的免疫原性强于DcDNA3.1-pilE。第六部分，将构建好的真核表达重组质粒作为DNA疫苗，免疫BALB／c小鼠，加强免疫后，用10倍LD50嗜肺军团菌L1型菌株对免疫小鼠进行攻击，并设空白和阴性对照组，对照组小鼠全部死亡后，检测肺组织带菌量和肺组织病理形态学变化，评价疫苗对动物的免疫保护性。小鼠肺组织保护效率的比较发现，各实验组保护效率均明显高于pcDNA3.1（+）空质粒对照组，pcDNA3.1-ip／pilE免疫组保护效率比pcDNA3.1-ip、pcDNA3.1-pilE免疫组高。病理形态学检测发现：空质粒pcDNA3.1（+）免疫组主要表现为炎性病变，镜下可见肺泡隔明显增宽，局部毛细血管扩张充血，并可见中性粒细胞及单核细胞浸润，肺泡腔内可见渗出物；而DNA疫苗实验组炎性病变较轻，所构建的DNA疫苗免疫组均能诱导小鼠产生一定的免疫保护效应。本研究结果表明：所构建的嗜肺军团菌DNA疫苗具有较强的免疫原性和免疫保护作用；pcDNA3.1-ip／pilE的免疫原性和免疫保护作用均高于其它免疫组。因此，pcDNA3.1-ip／pilE作为嗜肺军团菌DNA疫苗在今后的相关研究中值得作进一步探索。