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嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体,可导致流行、散在和非典型肺炎。嗜肺军团菌是一种兼性胞内寄生菌,广泛存在于各种自然水源及人工管道水源中,污染空调冷凝器、浴室、淋浴喷头等处后,人因吸入含有军团菌的气溶胶而感染,并在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖。嗜肺军团菌侵入肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞与外膜蛋白、Ⅳ型菌毛蛋白等有关。由嗜肺军团菌主要免疫原基因ip编码产生的29kDa外膜蛋白(29 kDa immunogenic protein,IP)在机体防御军团菌感染方面具有重要作用,是机体免疫应答反应的主要免疫原,也是军团菌致病因子,而其具体的机理仍不清楚。军团菌黏附于宿主细胞表面是其致病的先决条件,菌毛是细菌的黏附结构。嗜肺军团菌的pilE基因编码的Ⅳ型菌毛蛋白参与细菌多种功能活动:如黏附、活动力、特异靶细胞的识别及噬菌体的感染等。此外,29kDa外膜蛋白和Ⅳ型菌毛蛋白还是一种重要的保护性抗原。本研究在查阅分析国内外相关文献及结合本室研究进展的基础上,选择ip基因、pilE基因为疫苗候选基因,采用重叠延伸PCR法将嗜肺军团菌ip和pilE基因融合,构建ip基因、pilE基因及ip/pilE融合基因的重组真核表达载体作为DNA疫苗,检测其免疫原性和免疫保护性,为研制嗜肺军团菌DNA疫苗提供一定的实验依据。本研究共分六部分进行:第一部分,以嗜肺军团菌血清1型(L1)菌株基因组DNA为模板,采用常规PCR法扩增出792bp的ip基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-ip,经IPTG诱导有效表达出Trx-IP融合蛋白质。第二部分,采用PCR法从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pilE基因,将其定向克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-pilE,并诱导Trx-PILE融合蛋白在原核系统中高效表达。第三部分,采用重叠延伸PCR法将嗜肺军团菌ip和pilE基因融合,融合基因ip/pilE被定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达重组质粒pET-ip/pilE,经IPTG诱导表达出Trx-IP/PILE融合蛋白。第四部分,将ip基因、pilE基因和ip/pilE融合基因分别克隆入pcDNA3.1(+)中,得到真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip、pcDUA3.1-pilE和pcDNA3.1-ip/pilE。将这三种真核表达重组质粒分别用脂质体介导转染NIH3T3细胞,用免疫荧光法检测各克隆基因蛋白的瞬时表达,随后用Western-blot分别鉴定稳定转染的阳性细胞,均表达出相应大小的蛋白。第五部分,将构建好的真核重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫BALB/c小鼠两次,并设pcDNA3.1(+)、PBS组,检测免疫小鼠体内的抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ、IL-2产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性。结果发现,与空质粒对照组相比,各实验组均检测到不同程度的免疫原性,差异有显著性(P<0.01):pcDNA3.1-ip/pilE免疫组抗体的滴度高于pcDNA3.1-pilE免疫组(P<0.05);pcDNA3.1-ip/pilE免疫组细胞免疫各项指标均高于pcDNA3.1-ip、pcDNA3.1-pilE免疫组。pcDNA3.1-ip免疫组和pcDNA3.1-pilE免疫组相比,pcDNA3.1-ip的免疫原性强于DcDNA3.1-pilE。第六部分,将构建好的真核表达重组质粒作为DNA疫苗,免疫BALB/c小鼠,加强免疫后,用10倍LD50嗜肺军团菌L1型菌株对免疫小鼠进行攻击,并设空白和阴性对照组,对照组小鼠全部死亡后,检测肺组织带菌量和肺组织病理形态学变化,评价疫苗对动物的免疫保护性。小鼠肺组织保护效率的比较发现,各实验组保护效率均明显高于pcDNA3.1(+)空质粒对照组,pcDNA3.1-ip/pilE免疫组保护效率比pcDNA3.1-ip、pcDNA3.1-pilE免疫组高。病理形态学检测发现:空质粒pcDNA3.1(+)免疫组主要表现为炎性病变,镜下可见肺泡隔明显增宽,局部毛细血管扩张充血,并可见中性粒细胞及单核细胞浸润,肺泡腔内可见渗出物;而DNA疫苗实验组炎性病变较轻,所构建的DNA疫苗免疫组均能诱导小鼠产生一定的免疫保护效应。本研究结果表明:所构建的嗜肺军团菌DNA疫苗具有较强的免疫原性和免疫保护作用;pcDNA3.1-ip/pilE的免疫原性和免疫保护作用均高于其它免疫组。因此,pcDNA3.1-ip/pilE作为嗜肺军团菌DNA疫苗在今后的相关研究中值得作进一步探索。