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研究背景慢性鼻-鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)与鼻息肉(Nasal polyps,NPs)的发生密切相关,大约有20%的CRS患者同时伴有鼻息肉。大多数的NPs患者的上皮出现结构和功能异常,包括上皮增生和鳞状上皮化生,黏膜的慢性炎症和异常上皮组织重塑是其主要的组织学特征。由于NPs复杂的发病机制和较高的复发率,耳鼻喉科医师对其诊断和治疗面临着极大的挑战。相关研究表明,NPs的发生发展过程中上皮改变起到十分重要的作用。然而,由于缺乏鼻上皮干细胞特性的关键信息,仍然很难区别鼻腔上皮正常和异常修复的潜在机制。有研究表明鼻腔上皮中的基底细胞具有干/祖细胞的特性并在上皮修复方面起到重要作用。因此,通过体外培养及比较来自正常鼻腔黏膜和鼻息肉组织的鼻上皮干细胞有助于我们从一个不同的,更特殊的方面阐明鼻腔疾病的病理生理过程。多年来Ki67细胞核抗体做为评价细胞增殖能力的预测标记物已经被广泛应用。Ki67在所有活动的细胞周期都出现表达(G1期,S期,G2期和M期),但是在静止期不表达(G0期)。Ki67表达的增加与肿瘤的恶性程度有关,与组织的炎症程度相关(例如,哮喘,胆脂瘤)。既往研究显示,鼻息肉患者重塑上皮中Ki67阳性细胞数量,与正常对照组相比出现明显增加。到目前为止,大多数的研究应用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)方法分析Ki67抗体抗人Ki67蛋白(pKi67)的阳性表达水平。但是,较少的研究关注Ki67蛋白的分布情况(如,结构和位置),而这些方面可能对Ki67蛋白功能的研究更有意义。按照人Ki67蛋白(pKi67)在细胞周期的不同阶段,在培养的MCF7细胞中可以分成三种亚型:1)离散的颗粒分布在细胞核浆(早期G1);2)聚集的颗粒局限在核仁(S期到G2期);3)聚集物分布于染色体周边(M期)。本研究的目的就是通过体内及体外实验探讨鼻息肉上皮(增生的上皮和鳞状化生的上皮)以及正常鼻黏膜上皮中基底细胞类型以及基底细胞中Ki67蛋白的表达和分布类型。这些结果将同时与细胞周期相关标记物的mRNA水平进行比较。希望本研究结果能够为鼻息肉重塑上皮潜在的分子机制提供新的见解。实验方法1、构建人上鼻上皮干/祖细胞(hNESPCs)体外模型。将来源于鼻息肉黏膜和对照组下鼻甲黏膜经过酶消化后得到的分离细胞(原代细胞,P0)种植于准备好的NIH/3T3上,以2× 103细胞数/cm2的密度接种于24孔板在无血清培养基中生长。我们在hNESPCs细胞覆盖达80%的密度,使用酶消化的方法进行传代。每个样本在每一代通过计算克隆形成率和细胞倍增时间,来研究hNESPCs细胞的生长和增殖能力。hNESPCs细胞在气-液界面(Air-liquid interface,ALI)进行分化培养,通过免疫细胞荧光化学染色(IF)和纤毛摆动频率(CBF)测定进一步分析hNESPCs的分化能力并观察分化过程。2.Ki67蛋白在hNESPCs体外模型中表达及分布的研究。原代细胞种植后48小时或P1细胞(P2、P3)传代72小时后,福尔马林固定细胞用于免疫细胞化学染色,同时在这个时刻收集细胞的RNA用于进一步研究。我们采用倒置相差显微镜,每个样本选择三个视野(×400倍)观察并计数p63+细胞、K67+细胞以及p63+/Ki67+双重阳性细胞,观察分析Ki67阳性细胞的三种亚型并拍照。采用RT-PCR方法研究Ki67蛋白及细胞周期标记物mRNA水平在hNESPCs细胞传代过程中表达及分布情况。运用Mann-Whitney检验方法进行统计学分析。3.Ki67蛋白在鼻上皮细胞中表达及分布的体内实验研究。样本来自55例鼻息肉患者和18例正常对照组(下鼻甲)。其中15例鼻息肉患者经过3周糖皮质激素治疗,并在治疗前后分别取其息肉样本。部分组织固定于福尔马林溶液中进行IHC和IF染色用于组织学评估。另一部分组织采用RT-PCR方法进行mRNA水平检测。分类变量的组间不同的比较采用Fisher精确检验。运用Mann-Whitney检验分析鼻息肉组和正常对照组之间Ki67、p63阳性细胞数目、Ki67亚型的百分比、Ki67以及细胞周期标记物mRNA水平的表达情况。实验结果1.我们的研究证实可以从人鼻黏膜组织中分离和培养hNESPCs,并在至少前四代中能维持他们自我更新和分化的潜能。hNESPCs细胞可以成功的在气液界面上(ALI)分化成分泌细胞和纤毛细胞,与呼吸道的假复层上皮非常相似。鼠纤维细胞NIH/3T3可以用作hNESPCs在无血清培养条件下的饲养层。这有助于建立体外筛查和验证人鼻腔上皮细胞活性及其对治疗反应的体外模型。2.Ki67蛋白在hNESPCs体外模型中表达及分布的研究。在鼻息肉和下鼻甲黏膜来源hNESPCs细胞中发现了 Ki67蛋白三种亚型。下鼻甲来源的hNESPCs在体外传三代(P1,P2,P3)的过程中,Ⅰ型Ki67细胞占总体Ki67阳性细胞百分比分别为(18.0%,18.4%,18.6%),Ⅱ型Ki67细胞百分比分别为(82.0%,81.6%,81.4%)。然而,Ⅰ型Ki67细胞百分比在鼻息肉来源hNESPCs细胞传代过程中逐渐从20.0%,29.58%上升到40.0%而且Ⅱ型Ki67细胞百分比在细胞传代过程中逐渐从80.0%,70.14%下降到60.0%。此外,在P3代细胞中,Ⅰ型Ki67细胞百分比(p=0.04)与Ⅱ型Ki67细胞百分比(p=0.04)在鼻息肉来源的hNESPCs与正常鼻黏膜来源的hNESPCs之间的差异达到统计学意义。Ⅲ型Ki67细胞在鼻息肉和正常鼻黏膜来源的hNESPCs体外传代过程(P1-P3)中几乎没有观察到。G1期相关的细胞周期标记物(CCND1、CDK4和CDK6)以及促进S期进入有丝分裂期(M期)的细胞周期相关标记物(CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1)在鼻息肉患者中表达量与对照组相比出现了显著下降。M期的关键调节因子(CDK1、CCNA2和CCNB1)的mRNA表达水平在鼻息肉上皮的传代过程中与正常组相比差异没有达到统计学意义。3.Ki67蛋白在鼻上皮细胞中表达及分布的体内实验研究。与对照组相比,p63阳性细胞数目在鼻息肉增生上皮(1.53倍,p<0.0001)和鳞状上皮化生上皮(2.02倍,p<0.0001)明显增加。增生的基底细胞有三种类型(p63+/Ki67+)并出现在细胞周期的不同阶段,例如G1期(Ⅰ型细胞),S期到G2期(Ⅱ型细胞)以及有丝分裂期(Ⅲ型细胞)。最重要意义的是,一些Ⅰ细胞增殖后可能会进入静止期,虽然这些细胞仍然是p63+/Ki67+阳性细胞。Ⅰ型细胞与Ⅱ型细胞在正常鼻上皮中的比值是50:50。然而,鼻息肉增生上皮和鳞状上皮化生上皮中,Ⅰ型细胞的百分比与对照组相比,分别上升到63.03%和64.26%,Ⅱ型细胞的百分比分别降低到34.85%和30.77%,另外Ⅲ型细胞在鼻息肉鳞状化生的上皮中百分比是3.45%。G1期相关的细胞周期标记物(CCND1、CDK4和CDK6)和促进S期进入有丝分裂期(M期)的细胞周期相关标记物(CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1)在鼻息肉患者中的表达量要远远低于正常对照组的表达量。M期的关键调节因子(CDK1、CCNA2和CCNB1)在鼻息肉鳞状化生上皮的mRNA表达水平要明显超过鼻息肉增生上皮的表达量。IF结果显示鼻息肉患者经过GC治疗后Ki67阳性细胞数目6.0(4.0-8.0)与治疗前的数目13.0(8.0-16.0)相比出现了明显下降(p<0.05)。然而,鼻息肉患者的Ⅰ型Ki67细胞百分比和Ⅱ型Ki67细胞百分比之间的不平衡在经过3周GC治疗后并没有改善。实验结论总之,我们的研究成功的从人鼻黏膜组织中分离和培养hNESPCs细胞,并在至少前四代中能维持他们自我更新和分化的潜能。本研究首次表明Ki67细胞三种类型在鼻息肉重塑上皮的基底细胞中的异常表达和分布,以及其与细胞周期阶段的关系,这种异常表达和分布在用糖皮质激素治疗3周后并没有出现改善。由于细胞周期是动态的过程,阐明Ki67阳性细胞位置的细节特征及其与细胞周期的关系,能为这个广泛应用的标记物在鼻息肉上皮中研究提供的新视野。