大段感染性骨缺损至今仍是骨科治疗的难点之一,尽管目前用于大段感染性骨缺损的治疗方法较多,其中包括:游离腓骨移植技术、骨搬移技术、Papineau技术(开放植骨技术)、Masquelet技术(诱导膜技术)、抗感染重组活性骨(anti-infective reconstitued bone xenograft,简称ARBX)等等,但仍缺乏一种公认的简单有效的方法。由口腔外科医生发现的引导性组织再生(guidedtissue regeneration,简称GTR)现象延伸出来的引导性骨再生(guided bone regeneration,GBR)概念被创新应用于骨缺损的修复并获得了成功。笔者基于这种引导性骨再生概念,利用静电纺丝技术将万古霉素和聚己内酷(PCL)嵌合成一种带有微孔的药物缓释可吸收纤维膜,通过对该材料的体外细胞培养和体内动物实验的基础研究,探索一种简单有效的治疗长骨干大段感染性骨缺损的方法。因此本课题分为材料制备、体外细胞培养实验、体内动物实验及利用市售可吸收纤维联合植骨治疗四肢长骨骨缺损四部分,同时建立与临床上长骨大段感染性骨缺损类似的动物模型,通过对一些宏观指标以及微观的分子生物学检测手段和影像学检查,用科学的方法探讨此技术治疗长骨大段感染性骨缺损的可行性和有效性。第一部分载万古霄素的电纺纤维膜和兔同种异体骨植骨材料的制备目的:通过制备一种新型的载万古霉素电纺纤维膜和兔同种异体骨植骨材料,为修复兔股骨感染性骨缺损提供条件,同时获取理想的静电纺丝条件。方法:(1)在常温常压下,用DMP与丙酮按7:3的比例配制溶剂,15wt%聚S-己内酷在8{rC条件下溶入上述溶剂并在密封条件下进行磁力搅拌211。通过改变电纺电压、接收距离进行调试和选择,获取孔隙直径约lOjrni的纤维膜样品。(2)将万古霉素粉剂与前述的PCL溶剂按1:20的比例均勻混合并密封搅拌8h。按获取的条件制备电纺纤维膜。并对纤维膜进行电镜扫描检测。(3)从健康成年的雄性日本大耳兔获取四肢及骨盆的骨骼,利用人同种异体骨加工工艺制备出兔同种异体骨植骨材料。结果：在常温常压下,湿度40%-70%,5号注射器针头以10cm的距离,纺丝电压15KV的条件下获得的静电纺丝膜形貌特征较好。利用人同种异体骨制作工艺获得了形态较好颗粒状的兔同种异体骨植骨材料。结论：1.通过静电纺丝技术可以获得孔隙直径在lOjim以下的形貌特征较好的载万古霉素电纺纤维膜。2.利用人同种异体骨制作工艺可以成功制备兔同种异体骨植骨材料。第二部分载万古霉素的电纺纤维膜的体外药物缓释、生物相容性、对成纤维细胞迁移影响的实验研究目的:通过细胞培养实验的基础研究,探讨载万古霉素的电纺纤维膜的药物缓释作用、生物安全性以及对成纤维细胞迁移的影响。方法：(1)细胞毒性检测切取5片材料(规格为IcmXlcm)置含10%胎牛血清的a-MEM培养液中,获取静置浸提液。在7F2成骨细胞培养孔分别加入500pL相应的浸提液,同时设置正常细胞培养孔(只加入完全培养液培养的细胞)和空白孔(没有细胞,只加入相同量的完全培养液)用于调零。培养箱中分别培养Oh、48h和96h,加入270^11^新鲜培养液和30nLAlamar Blue®reagent。37°C下继续避光孵育4h,收集590mn处各孔的焚光信号。(2)焚光显微镜观察载万古霉素的电纺纤维膜对成骨细胞生长的影响切取纤维膜材料(规格为IcmXlcm)与20ug/tnL胶原酶I在37°C环境下孵育过夜后,将7F2成骨细胞悬液加在材料表面,每孔lOOOpL,200000个细胞/孔。细胞培养Id和4d后,4%多聚甲薛溶液固定后,加入0.1%Triton X-100(PBS配制)破膜。再与TRITC-phaUoidin过夜孵育后避光与l^ig/mL DAPI溶液孵育,倒置突光显微镜进行观察。(3)载万古霉素的电纺纤维膜的VAN体外释放实验切取纤维膜材料(规格为2.5cm X 2.5cm)浸没在lOOmLPBS中,37°C恒温摇床中解育(lOOrpm/min)。分别在畔育后的m、12h、Id、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、lOd、lid、12d、13d和14d时取ImL孵育液,离心(5000rpm,Smin)取lOOjiL上清进行荧光检测(485mn激发,538nm发射)。(4)Transwell法检测载万古霉素的电纺纤维膜对成纤维细胞迁移的影响切取纤维膜材料(规格为IcmXlcm)与20ug/mL胶原酶I在37°C环境下孵育过夜后,将材料覆盖在Transwell小室中滤膜上方。调整3T3-L1成纤维细胞悬液浓度至5X10VmL,取细胞悬液20(HiL加入材料表面,下室加入SOOpL含10%FBS的培养液。培养箱中孵育24h、48h和72h后,取出Transwell小室,甲醇固定,0.1%结晶紫染色,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,倒置显微镜观察细胞形态。结果：1.载万古霉素的电纺纤维膜对成骨细胞无明显毒性作用且不影响成骨细胞的增殖;2.VAN体外释放试验结果提示载万古霉素的电纺纤维膜中万古霉素的释放量在24小时内有一个快速释放趋势,24小时后呈现出缓慢释放趋势;3.Transwell法检测结果提示在最初的24小时内几乎没有成纤维细胞通过,但72小时后一部分成纤维细胞通过了纤维膜。结论：(1)载万古霉素的电纺纤维膜具有良好的生物相容性和安全性。(2)载万古霉素的电纺纤维膜具有较好的药物缓释作用。(3)载万古霉素的电纺纤维膜对成纤维细胞迁移具有一定程度的影响。第三部分载万古霉素的电纺纤维膜联合植骨修复兔股骨感染性骨缺损的实验研究目的:通过体内实验动物的基础研究,探讨载万古霄素的电纺纤维膜联合植骨修复感染性骨缺损的可行性及有效性。方法:实验动物造模与分组治疗:24只兔建立兔股骨大段感染性骨缺损模型,微型外固定支架固定,同时随机设立实验组及对照组,各组实验动物经严格清创后,实验组给予载万古霉素可吸收PCL纤维膜包裹兔同种异体骨植骨材料治疗,对照组1给予兔同种异体骨植骨材料单纯填充骨缺损区治疗,对照组2给予载万古霉素可吸收PCL纤维膜单纯包裹骨缺损区,膜内不填充任何材料进行治疗。(1)手术当日和术后12周取创面中心肉芽组织,依据后续试验要求保存,并观察创面大体观。(2)对各样本行细菌计数检测,了解感染造模成功与否和后期创面感染控制情况。(3)对术后12周样本行HE及Masson染色,观察组织炎性细胞浸润及新生骨组织形成情况。(4)对各组动物于术后4周、8周、12周行放射影像学检查:记录各组骨缺损愈合时间及骨缺损愈合率。结果：(1)术后0天见所有创面潮湿,组织充血明显,且见脓性分泌物。术后12周观察创面,见实验组、对照组2创面分泌物明显少于对照组1,肉芽组织新鲜,质量明显好于对照组1。(2)术后0天,所有创面都检出细菌,且为单一金葡菌,数量都大于IX105cfu/ml,证明感染创面造模成功。术后12周创面中心的组织中细菌数实验组、对照组2小于对照组1,差异有统计学意义。(3)术后12周实验组和对照组2炎性细胞数显著低于对照组1,差异有统计学意义。HE染色显示实验组和对照组2的缺损区组织炎性细胞浸润明显好于对照组1,Masson染色显示新生骨组织形成情况明显优于对照组1,差异有统计学意义。(4)术后4、8、12周骨缺损处骨痂生长情况实验组明显好于各对照组,对照组2好于对照组1,4、8、12周时骨愈合率实验组明显高于对照组1。结论：(1)载万古霉素的电纺纤维膜可有效控制感染性骨缺损创面的感染情况。(2)载万古霉素的电纺纤维膜联合植骨可成功修复感染性骨缺损。第四部分利用市售的可吸收纤维膜联合植骨治疗四肢长骨干骨缺损的临床研究目的:观察利用市售的可吸收纤维膜联合自体松质骨植骨修复四肢长骨骨缺损的临床疗效。方法:对2012年8月至2013年8月期间我科收治的19例四肢长骨骨缺损患者,骨缺损范围大小为1.5cm-5.0cm,经创面严格清创后,给予髓内钉或钢板内固定,骨缺损区予以自体松质骨颗粒填充植骨,采用市售的可吸收纤维膜(Fibrillar?,TthiconLLC,USA)包绕缺损区,术后常规抗感染治疗。观察手术切口一般情况,查血沉及C-反应蛋白。结果：(1)所有患者术后一般情况均表现良好,术后体温正常,术后复查血沉、C-反应蛋白均有不同程度升高,C-反应蛋白较快恢复正常值范围,血沉缓慢下降。17例患者术后切口一期愈合。2例患者术后切口有少许渗出,细菌培养结果阴性,切口延期愈合。(2)18例术后获得12-18个月的随访,平均14.3个月;17例获得完全骨性修复,愈合时间4一8个月,平均5.3个月,1例患者术后8个月仍未获得骨性愈合,给予二次植骨(未包裹可吸收纤维膜)后于再次手术后4个月获得骨性愈合。无一例发生感染及并发骨髓炎。愈后外观及功能均较为满意。结论：利用市售的可吸收纤维膜联合自体松质骨颗粒植骨可以成功修复四肢长骨骨缺损。