【摘 要】
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Sec14超家族广泛存在于酵母、植物及哺乳动物中,是一类脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)。该超家族成员共有的Sec14结构域是脂质转运结构域(lipid transfer domain,LTD),包含一个脂质结合口袋,能够结合、转运脂质。首先,酵母中表达了 6个Sec14同源蛋白,包括酵母Sec14蛋白(Sec14p)及其同源蛋白(Sec14p homologu
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Sec14超家族广泛存在于酵母、植物及哺乳动物中,是一类脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)。该超家族成员共有的Sec14结构域是脂质转运结构域(lipid transfer domain,LTD),包含一个脂质结合口袋,能够结合、转运脂质。首先,酵母中表达了 6个Sec14同源蛋白,包括酵母Sec14蛋白(Sec14p)及其同源蛋白(Sec14p homologues,Sfh),研究发现这些蛋白通过其Sec14结构域能够结合、转运多种磷脂。其中,酵母Sec14p是Sec14超家族的原型,被鉴定为一种磷脂酰肌醇转运蛋白,它对于高尔基复合体的蛋白转运功能是必需的。随后,在哺乳动物源体系中发现了多个Sec14同源蛋白,其通过Sec14结构域能够结合磷脂或小分子。此外,多个结构生物学研究阐述了酵母及哺乳动物中Sec14同源蛋白的Sec14结构域识别配体的分子机制。植物中也存在大量Sec14同源蛋白,但对其结合脂质的能力及机制均不清楚。拟南芥中共表达32个不同的Sec14同源蛋白,分为三个亚家族,即AtPITP、AtSFH及AtPATL。本论文的研究对象为与酵母Sec14p的序列同一性最高的AtSFH亚家族,该亚家族含14个AtSFH蛋白。其中,AtSFH11和AtSFH14只含有Sec14结构域,而其他AtSFH蛋白均含有一个N端Sec14结构域和一个C端Nodulin结构域。本论文的研究重点为AtSFH蛋白的Sec14结构域。首先,我们从拟南芥cDNA文库中扩增了 AtSFH的全长基因,并在体外构建了其全长及Sec14结构域的克隆;其次,在大肠杆菌体系中表达重组蛋白,通过一系列纯化方法得到高纯度的蛋白样品;随后,利用蛋白-脂质覆盖实验及NBD标记脂质的结合实验,对得到的AtSFH的Sec14结构域蛋白进行脂质结合能力研究。实验结果证明了 AtSFH的Sec14结构域能够结合PC、PE及多种PIP。最后,对优质的AtSFH的Sec14结构域蛋白进行结晶实验,并成功获得AtSFH1/4的Sec14结构域的晶体。通过一系列优化程序,初步解析了 AtSFH1-Sec14结构域的结构。
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