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水稻(Oryza sativa L.)是最重要的粮食作物之一,也是世界1/2以上人口的主食。但由真菌Magnaporthe oryzae侵染引起的稻瘟病可以造成水稻的大幅度减产,严重时甚至颗粒无收。我国作为世界最重要的水稻产区,稻瘟病是我国水稻最主要的病害之一。选育和推广抗病水稻新品种(组合)是控制稻瘟病最安全、经济与环保的措施。但田间稻瘟病菌群体变异频繁,常常导致抗病水稻品种在应用数年后就丧失抗病能力。水稻品种对稻瘟病的抗性主要表现为部分抗性,即数量抗性或田间抗性,这是由多基因控制的抗性。因此,研究人员着力于不断挖掘不同种植区水稻的抗稻瘟病基因,然后才能希望利用不同基因的组合,培育出抗稻瘟病的水稻新品种。本文以感病亲本品种C039及其抗病近等基因系C101LAC、C101A51、 C101PKT和C105TTP-4L23(简称CN-1、CN-2、CN-4a和CN-4b)为材料,以稻瘟病菌高毒力菌株GUY11和福建流行菌株81278ZB15为胁迫因子,应用基因组重测序、RNA-seq、双向电泳(2-DE)、质谱(MALDI-TOF-MS/MS)等技术,从DNA、RNA和蛋白质三个层次,系统地开展水稻抗稻瘟病基因的挖掘及其表达模式研究,取得如下研究结果。1.水稻抗稻瘟病QTLs的整合首先对现有文献已报道的水稻抗稻瘟病QTLs进行元分析,整合获得24个水稻抗稻瘟病Meta-QTLs位点,平均每个位点的大小为2.7Mbp。元分析缩小了QTLs的置信区间,提高了QTLs定位的精度,同时也整合了前人的同类研究成果。在此基础上,将24个Meta-QTLs上下游标记的遗传距离映射到RAP-DB数据库水稻日本晴基因组上,获得各Meta-QTLs的物理图距,发现在24个Meta-QTLs上共有7949个基因,结合R基因的NBS-LRR结构,定位到其中有111个NBS-LRR型R基因,进一步压缩了水稻抗稻瘟病基因的筛选范围。2、水稻抗稻瘟病Meta-QTLs上潜在抗稻瘟病基因的筛选应用基因组重测序技术,结合感病亲本C039及其抗稻瘟病的4个NILs品系对两种稻瘟病菌菌株的不同抗感性状表现,从抗GUY11菌株的CN-4b品种的抗稻瘟病Meta-QTLs位点上挖掘出潜在抗GUY11菌株的基因203个,4个供试NILs品种分别特有的潜在抗81278ZB15菌株的基因202、192、74和289个,共有的潜在抗81278ZB15菌株的基因13个。再次压缩了水稻抗稻瘟病基因的筛选范围。3、水稻抗稻瘟病Meta-QTLs上RNA差异表达分析应用RNA-seq技术,分析两种稻瘟病菌菌株侵染下水稻RNA的差异表达,结合各供试水稻品种对两种稻瘟病菌菌株侵染的抗感性状表型,筛选到201个GUY11侵染24h下抗病水稻特有差异表达的RNA,其中10个是上述筛选到抗GUY11的基因,包括5个上调表达和5个下调表达基因,从基因和RNA表达水平揭示该5个基因对水稻抗GUY11侵染能力的贡献作用。而且其中3个上调表达基因的功能未知,是下一步开展抗稻瘟病基因功能试验分析的首先研究对象。同时,本文研究也发现稻瘟病菌侵染24h水稻差异表达的基因明显多于48h,说明稻瘟病菌侵染24h是水稻应激防御的关键期。4、水稻抗稻瘟病菌胁迫的蛋白质差异表达分析应用差异蛋白质组学技术,鉴定两种稻瘟病菌菌株侵染下供试水稻品种共有的50个差异表达蛋白质,对其表达量聚类分析发现,两种菌株侵染的蛋白质表达模块分别聚为两大类,说明水稻对两种菌株侵染的蛋白质表达模式不同,也说明两种菌株具有不同的侵染机制。功能模块聚类的结果也获得相同结论。同时,研究结果表明抗GUY11的CN-4b在胁迫的24和48h聚为一类,有别与其他供试品种,进一步挖掘发现其中26个蛋白质在CN-4b中表达量高于其他品种,也就是说该26个蛋白质的高表达使CN-4b具有与其他品种不同的抗GUY11菌株的能力。在26个高表达的蛋白质中,有12个其RNA也是高表达。从RNA和蛋白质层次,说明该12个蛋白质在水稻抗GUY11菌株侵染中的重要作用。菌株81278ZB15侵染下,各供试水稻品种的蛋白质表达聚类跨度较大,但仍能发现被侵染24h和48h的CN-4b与侵染24h的CN-4a聚为一类。再次说明CN-4b具有不同于其他品种较强的抗稻瘟病能力。总之,本文研究逐步缩小了水稻抗稻瘟病基因的筛选范围,甚至获得了3个在GUY11侵染下抗病的CN-4b中上调表达的潜在抗稻瘟病基因。同时,从转录组层次阐述了稻瘟病菌侵染24h是水稻应激反应的关键期,也从差异蛋白质组学数据探究了品种间抗稻瘟病能力差异的蛋白质表达基础。本文研究为水稻抗稻瘟病基因的功能分析指明了方向,也为培育出抗稻瘟的水稻新品种奠定了理论基础。