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虽然分别在气孔调控的信号传导机制和臭氧对气孔运动的影响方面均有大量研究并取得重要进展,但臭氧诱导气孔运动的信号调控机制却仍是一个亟待研究的问题。本研究以模式植物蚕豆(Vicia faba)为研究对象,利用开顶式气室(OTC)采用臭氧熏气和离体表皮条法研究了在不同浓度臭氧诱导下植物气孔运动的反应规律。结合植物生理学、生物化学和分子生物学最新研究进展及方法,利用激光共聚焦显微镜,从活性氧自由基(ROS)及相关的控制植物气孔运动的信号分子为切入点,探讨了介导臭氧诱导气孔运动的信号分子ROS的起源以及信号传导的相关机理,取得了如下主要成果：1.臭氧改变了气孔的运动方式为了研究臭氧对处于关闭状态下气孔运动的影响,将保持在黑暗状态下12小时的成熟蚕豆叶背面的表皮条分别用含有不同浓度03的Mes-KCL缓冲液或者在分别加入过氧化氢酶(CAT)、二亚苯基碘鎓(DPI)或抗坏血酸(Vc)的情况下进行处理,并诱导其开放。气孔的开度在处理的不同时间段分别进行测定。在研究臭氧对处于开放状态下气孔运动影响的试验中,将保持在黑暗状态下12小时的成熟蚕豆叶背面的表皮条分别用Mes-KCL缓冲液在促进气孔开放的条件下培育3小时,诱导气孔开放,然后再转移到分别含有含有不同浓度O3的Mes-KCL缓冲液中或者在分别加入CAT、DPI或Vc的情况下进行处理,使其在促进气孔开放的条件下再培育3小时,气孔开度的测定同上述。在上述条件下处理的表皮条,经过03处理的气孔运动与对照比较发生了显著的改变。03显著的抑制了原本关闭的气孔的开放,同时对事先开放的气孔的关闭具有明显的促进作用。在03浓度低于150 nLL-1时,03对气孔开放的抑制作用不明显；当O3浓度大于150 nL L-1时,03显著(P<0.05)抑制气孔的开放。而当O3浓度大于450 nL L-1时则显著促进气孔关闭。同时我们也发现03在促进气孔关闭的过程中,具有明显的浓度依赖性,850 nL L-1 O3在2.5小时使气孔最大程度地关闭,这时的气孔开度只有7.7%[(宽/长)×100%],仅为对照的13%。然而,这时的气孔仍然完全具有恢复的功能。相反,当O3浓度大于1500 nLL-1时,气孔就失去了由关闭到开放的可逆性,同时表现出了保卫细胞的死亡。另外,我们在OTC中对完好无损的整株蚕豆进行不同浓度的03熏气处理后,并使植物处于能够诱导气孔开放的条件下,同样会得到O3显著的抑制了原本关闭的气孔的开放,同时对事先开放的气孔的关闭具有明显的促进作用。当对气孔进行03处理的Mes-KCL缓冲液中同时分别加入CAT、Vc和DPI时,CAT和Vc能够有效地抑制03所促进的气孔关闭；DPI能够在一定程度上减弱03所诱导的气孔关闭。CAT、Vc和DPI同样对O3所抑制的气孔开放具有拮抗作用。上述表明,O3不仅能够促进开放的气孔关闭,而且能够抑制关闭的气孔的开放,说明O3对植物的气孔运动具有重要的影响；ROS清除剂或ROS生成抑制剂可消除或显著地降低O3对气孔运动的影响作用,表明ROS(在活细胞内主要表现为具有较长寿命的H202)作为一种信号分子介导了03所诱导的气孔运动。2.臭氧可诱导保卫细胞内的ROS爆发不具有荧光的二氯荧光黄(H2DCF),在过氧化物酶的催化下通过H202的氧化就能产生具有高强度荧光的DCF。因此,细胞内ROS的多少可以通过DCF荧光强度的强弱显示出来。将加载有二氯荧光黄的蚕豆叶下表皮条转移到不同浓度的03溶液中进行处理大约2.5分钟,在激光共聚焦显微镜下进行观察,发现只有在活体保卫细胞中出现了显著增强的DCF荧光,并且荧光强度随着03浓度的加大而逐渐增强,而气孔周围的表皮细胞中以及细胞间隙的荧光与对照相比基本没发生变化。但当03的浓度大于1500 nL L-1时,保卫细胞中的DCF荧光强度却出现了显著的下降,而其周围的表皮细胞内及细胞间隙的DCF荧光则非常突出,表明高浓度的03溶液导致保卫细胞死亡,保卫细胞的细胞膜由于高强度的氧化而溃解,从而使保卫细胞内的荧光向表皮细胞中扩散。以上说明在O3激发下,ROS是由保卫细胞通过诱导自身大量产生的,而非O3裂解的结果,否则由ROS氧化H2DCF所产生的荧光会在整个表皮条中弥散。03诱导下的ROS产生只发生在保卫细胞中,说明保卫细胞内产生ROS的结构成分在表皮细胞中是缺失的。3.在受臭氧激发时保卫细胞中的叶绿体是产生ROS的关键成分在用含有CAT、Vc的O3溶液处理加载有H2DCF蚕豆叶表皮细胞时,保卫细胞内的DCF荧光强度出现了极其显著的降低。用含有DPI的03溶液处理加载有H2DCF蚕豆叶表皮条时,保卫细胞内的DCF荧光强度只显现出了一定程度不太显著的下降,说明NADP氧化酶参与了ROS的产生,但不是产生ROS的唯一成分。经过03溶液处理的蚕豆叶表皮,ROS的显著增强主要集中在保卫细胞中,而保卫细胞周围的表皮细胞中的ROS与对照相比基本上没有改变。表皮细胞与保卫细胞的结构组成的重要差异之一是保卫细胞中含有叶绿体。敌草隆(DCMU),叶绿体类囊体膜上的电子传递抑制剂。经过DCMU和O3处理的加载有H2DCF蚕豆叶表皮细胞,其上的荧光强度与未经过任何处理的对照中的表皮条荧光强度没有明显的差异,保卫细胞内的ROS爆发几乎完全被抑制。上述结果表明叶绿体在03诱导过程中是ROS爆发的最为重要的部位。根据我们试验的其它数据对比发现,叶绿体的ROS爆发对细胞内其它结构成分产生ROS也具有极其关键的影响。叶绿体内ROS产生一旦受到抑制,细胞内其它结构成分产生ROS的活性也不能显现出来。综上所述,在03的胁迫下,气孔的运动行为发生了很大的变化,03不仅能够促进开放的植物气孔关闭,而且能够抑制关闭的气孔开放,并且抑制关闭气孔开放的O3浓度阈值(150 nL L-1)要比促进气孔关闭的阈值(450 nL L-1)要低；植物在受到03胁迫时,其细胞内的ROS是由03诱导而产生,并非是03裂解转变的结果；ROS是介导03所诱导的气孔运动行为发生变化的重要的信号分子；在03激发下,植物叶绿体是ROS爆发的主要结构成分,同时其也控制着细胞内其它结构的ROS产生。