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树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前已知的功能最强的专职抗原递呈细胞,具有刺激初始T细胞增殖的独特功能。成熟DC可将抗原递呈给T细胞,从而激活T细胞,启动免疫应答。人们对于免疫应答调控的研究历来非常重视,因为免疫应答是否能有效启动或控制在一定程度内,直接关系到机体对外界侵害的抵抗作用,或与免疫性疾病的发生有关。除了T和B细胞的负性调控外,近年来对于在免疫应答中已完成了抗原递呈功能的DC的调控作用及机制特别是负性调控方式及机制开始关注并进行研究。已有报道,用抗原体外冲击荧光标记的DC,然后与转有相应抗原的特异TCR基因的T细胞一起回输至小鼠体内,48小时后,在淋巴结内找不到荧光标记的DC。体外实验证实,在抗原存在的情况下,DC与抗原特异性的CD4+ T细胞混合培养后,短时间内即可检测到DC凋亡,提示DC在活化T细胞的同时,亦受到来自于T细胞的作用,引起自身的凋亡,以有效地下调免疫应答。DC是通过何种方式来诱导凋亡而实现负性调控的?对此问题的回答,目前的研究,主要集中在两个方面:Fas系统和 MHCⅡ类分子,但并没有取得确切的结论。所以,为进一步阐明这一问题,我们分别从这两个方面入手,对活化的T细胞可能引起DC凋亡的因素进行了初步探究。本文主要分以下两部分内容。一、Fas信号对DC成熟和抗原递呈功能的促进作用及其信号传导机制活化后细胞死亡(Activation-induced cell death, AICD)是机体调控免疫反应、防止其过度活化的一种主要机制。TNF受体超家族成员包括Fas是其中重要的介导分子。但是,DC是否可以通过Fas诱导凋亡,一直处于争议之中。我们用Fas的特异性的激活性抗体Jo-2处理DC,观察了Fas信号对DC的表型及功能的影响,并对其机制进行了初步探讨。结果发现,虽然DC表面表达Fas,但是,无论是非成熟DC还是成熟DC, 激活性抗Fas抗体Jo-2均不能诱导其凋亡。相反,Jo-2可以促进DC表型的成熟包括 MHCⅠ、Ⅱ类分子和共刺激分子表达的上调以及功能的活化包括分泌IL-1(及内吞功能、刺激同种异体T细胞增殖功能、抗原递呈功能的增强。我们检测了caspase1的活化情况,发现,caspase1在Jo-2作用0.5小时后即可被活化,而且,泛caspase抑制剂ZVAD-fmk和caspase1的特异性抑制剂 Ac-YVAD-CMK都可以抑制IL-1(的产生,同时也抑制了DC表型的变化,说明Jo-2是通过活化caspase1,促进了IL-1(的分泌。因为已有报道,IL-1(可以诱导DC成熟,因此,我们推测,Jo-2是在IL-1(的作用下,间接地引起DC发生表型及功能的变化。另外,我们对可能被Fas活化的信号分子进行了筛选,发现,ERK抑制剂PD98059 可以抑制Jo-2作用后IL-1(的分泌及表型变化,表明ERK参与<WP=6>了Jo-2刺激DC分泌IL-1(的过程。用RT-PCR方法,检测胞内IL-1(的mRNA水平,发现与LPS的作用不同,Jo-2不能活化IL-1(基因的表达。提示我们,DC将抗原递呈给T细胞并活化T细胞后,T细胞表达FasL, 与DC表面的Fas 结合,活化ERK和caspase1,迅速诱导IL-1(的分泌,从而进一步活化DC, 增强DC的功能,使T细胞充分活化和增殖,对免疫应答起正调控作用。另外,我们检测到NF-(B的活化, 用抑制剂PDTC抑制其活化,并不影响Jo-2作用后IL-1(的分泌及表型变化,表明刺激IL-1(分泌的信号传导通路与NF-(B的活化无关。但是,抑制NF-(B的活化可以造成DC对Fas诱导凋亡的敏感性增高,表现为R123低标记细胞的增加,说明Jo-2通过NF-(B的活化向DC传递存活信号。我们的结果表明,在DC,Fas系统并不向胞内传递凋亡信号,而是活化信号:它可以促进DC的表型成熟和功能活化。二、IFN-(与抗MHC Ⅱ类分子抗体联合诱导DC活化后死亡尽管有报道提出某些MHCⅡ类分子抗体可以诱导DC凋亡,但我们分别用两种已报道的可诱导凋亡的 MHCⅡ类分子抗体2G9或抗MHC Ⅱ 类分子抗体处理DC, 多次实验均未发现凋亡的发生。因为DC诱导T细胞活化后可促进其分泌IFN-(,可能参与DC的负调控。所以,我们用IFN-(预处理一定时间后,再用抗 MHCⅡ类分子抗体抗MHC Ⅱ 类分子抗体作用DC,发现可以诱导DC的凋亡。而且,凋亡的DC为CD86阳性细胞,凋亡后CD86表达下调,这可能与其功能相适应:CD86阳性为成熟DC,在它完成抗原递呈功能之后,适应性地下调CD86的表达,发生凋亡。由于 MHCⅡ类分子抗体可以引起DC的聚集,IFN-(预处理后聚集增强,我们设想,黏附分子是否参与了诱导凋亡的过程。有报道证实,CD18对HLA-DR引起的人单核细胞的凋亡很关键。但是,虽然DC表面也表达ICAM-1和LFA-1,抗CD18抗体阻断其接触却并不影响IFN-(和抗 MHCⅡ类分子抗体诱导的DC凋亡。泛caspase阻断剂ZVAD-fmk亦不能阻断DC的凋亡,提示IFN-(和抗 MHCⅡ类分子抗体诱导的DC凋亡为非caspase依赖性的。由于NO是诱导DC凋亡的原因之一,我们检测了IFN-(与抗 MHCⅡ类分子抗体联合作用后NO产生的变化,发现,IFN-(与抗 MHCⅡ类分子抗体联合作用后产生NO的水平并无明显增高,提示,NO不是引起IFN-(与抗 MHCⅡ类分子抗体联合作用诱导DC凋亡的原因。IFN-( 处理24小时后,加入抗 MHCⅡ类分子抗体抗体,作用不同时间后,I(B 的磷酸化程度无明显改变,,提示我们NF-(B 不参与IFN-(和抗 MHCⅡ类分子抗体诱导的DC凋亡?