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目的:1.比较分析胃癌细胞SGC-7901和正常胃黏膜上皮细胞GES-1中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK等基因的表达差异,验证PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌中的激活情况。2.观察mTOR抑制剂rapamycin对胃癌MGC-803细胞的影响,探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路调控胃癌细胞生长的可能分子机制,为该通路抑制剂应用于临床提供更多的实验依据。3.观察并探讨PD98059对胃癌SGC-7901细胞信号转导的影响及其作用机制,以期为胃癌的基础研究和临床治疗提供更多的实验依据。4.研究mTOR抑制剂rapamycin和MEK抑制剂PD98059联合应用对胃癌SGC-7901细胞是否具有协同效应,探讨PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路的相互作用,揭示这两条信号通路的相互调控机制,为制定胃癌基因水平的预防和治疗以及为临床研究新的靶向治疗药物及寻求新的联合治疗方案提供学术依据。方法:1.体外培养人低分化胃癌细胞株SGC-7901和正常胃黏膜上皮细胞GES-1,实时荧光定量PCR技术测定PI3K/AKT/mTOR信号通路关键信号分子PI3K、AKT、mTOR和MAPK/ERK信号通路关键信号分子MEK、ERK等相关基因的mRNA表达;Western Blot法检测总蛋白AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2 和磷酸化蛋白 p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2 的定量表达。2.应用mTOR靶向抑制剂rapamycin干预胃癌细胞株MGC-803.T法检测rapamycin对细胞增殖的影响;RT-qPCR 测定 PI3K、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K 等基因的 mRNA 表达;Western Blot检测各总蛋白 mTOR(Ser2448)、P70S6K和磷酸化蛋白 p-mTOR(Ser2448)、p-P70S6K(Thr389)的定量表达;Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率变化。3.应用MEK靶向抑制剂PD98059干预胃癌细胞株SGC-7901。CCK-8法检测PD98059对细胞增殖活性的影响;RT-qPCR检测MEK、ERK等基因的mRNA表达;Western Blot检测各总蛋白MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白p-MEK1/2、p-ERK1/2的定量表达;流式细胞术检测PD98059对SGC-7901细胞周期分布和凋亡率的影响。4.根据rapamycin和PD98059抑制胃癌细胞的增殖实验结果各选取一个药物浓度点,设计单独用药及联合用药分组:对照组、rapamycin组、PD98059组、联合组。RT-qPCR检测PI3K/AKT/mTOR信号通路关键信号分子PI3K、AKT、mTOR和MAPK/ERK信号通路关键信号分子MEK、ERK等相关基因的mRNA表达。Western Blot检测各组总蛋白AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白 p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2 的定量表达。Annexin V-FITC/PI 染色结合流式细胞术检测单独用药及联合用药对SGC-7901细胞周期分布和凋亡率的影响。结果:1.PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK通路关键信号分子在SGC-7901和GES-1细胞中的表达研究RT-qPCR测定PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表达,扩增曲线良好,溶解曲线表明特异性良好。SGC-7901细胞中的mRNA表达水平显著高于GES-1细胞中的表达水平,具有显著性差异(P<0.05)。胃癌SGC-7901细胞和正常胃黏膜上皮细胞GES-1中总mTOR、AKT、MEK、ERK蛋白的表达水平组间无显著性差异(P>0.05)。但SGC-7901细胞中磷酸化蛋白p-mTOR、p-AKT、p-MEK、p-ERK蛋白的表达均显著高于GES-1细胞,差异具统计学意义(P<0.05)。2.mTOR抑制剂Rapamycin对胃癌MGC-803细胞生物学功能的影响与对照组相比,不同浓度rapamycin对MGC-803细胞均有抑制作用,且随着rapamycin浓度的增加,MGC-803细胞增殖能力逐渐下降,抑制作用呈现剂量依赖性(P<0.01)。实验组的PI3K、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K基因的mRNA表达与对照组相比,随着rapamycin浓度升高,其表达量均逐渐降低(P<0.01)。实验组总蛋白mTOR(Ser2448)、P70S6K表达无明显差异,磷酸化蛋白p-P70S6K(Thr389)、p-mTOR(Ser2448)随着抑制剂浓度的增加蛋白表达量逐渐降低(P<0.05)。实验组G0/G1期细胞比例逐渐上升,高于对照组(P<0.01),S期细胞比例均低于对照组(P<0.01),G2/M期细胞比例逐渐下降,均低于对照组(P<0.01)。实验组凋亡率高于对照组(P<0.01),且随着浓度的增加而增加,呈现剂量依赖性。3.PD98059靶向抑制MAPK/ERK信号通路对胃癌SGC-7901细胞的影响实验组SGC-7901细胞增殖率均低于对照组(P<0.01)。在一定范围内,随着PD98059浓度的增加,SGC-7901细胞增殖能力逐渐下降,抑制作用呈现剂量依赖性。当抑制剂浓度达到200μmol/L时抑制作用趋缓,达到300μmol/几时进入平台期,增值率无明显变化,300μmol/L浓度组与400μmol/L浓度组间无差异(P>0.05)。实验组的MEK、ERK基因的mRNA表达量均低于对照组(P<0.01)。随着PD98059浓度的增加,ERK基因的mRNA表达量逐渐下降,呈现剂量依赖性(P<0.01)。50μmol/L浓度组MEK基因的mRNA表达量高于25μmol/L、100μmol/几浓度组,低于对照组。与对照组相比,25μmol/L浓度组MEK1/2蛋白表达无变化(P>0.05),而50μmol/L、100μmol/几浓度组表达高于对照组(P<0.05);25μmol/几浓度组p-MEK1/2表达与对照组相比无明显差异(P>0.05),而50μmol/L、100μmol/几浓度组表达低于对照组(P<0.05),并呈现剂量依赖性;各浓度组总ERK1/2表达无显著差异(P>0.05),而各组磷酸化蛋白p-ERK1/2随着抑制剂浓度的增加蛋白表达量逐渐降低(P<0.05)。与对照组相比,实验组G0/G1期细胞比例逐渐上升,高于对照组(P<0.01),S期细胞比例逐渐升高,均低于对照组(P<0.01),G2/M期细胞比例逐渐下降,均低于对照组(P<0.01)。25μmol/L、50μmol/L浓度组凋亡率随着浓度的增加而增加,呈现剂量依赖性(P<0.01),而50μmol/L和100μmol/几浓度组间凋亡率无统计学差异(P>0.05)。4.mTOR抑制剂Rapamycin联合MEK抑制剂PD98059对胃癌细胞的协同作用及机制研究rapamycin组和PD98059组的AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表达量均低于对照组(P<0.05),联合组的AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表达量均低于各单独用药组(P<0.05)。各组总AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达量与对照组相比无明显差异(P>0.05)。rapamycin组和PD98059组磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2表达量均低于对照组(P<0.05)。联合用药组磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2表达量均低于rapamycin组和PD98059组(P<0.05)。rapamycin组和PD98059组G0/G1期比例高于对照组(P<0.01),联合组G0/G1期细胞比例高于rapamycin组和PD98059组(P<0.01)。rapamycin组和PD98059组S期细胞比例均低于对照组(P<0.01),联合组S期细胞比例低于rapamycin组和PD98059组(P<0.01)。rapamycin组G2/M期比例低于对照组(P<0.01),而PD98059组G2/M期细胞比例与对照组相比无显著差异(P>0.05),联合组G2/M期比例低于对照组(P<0.05)。rapamycin组和PD98059组凋亡率均高于对照组(P<0.01)。联合组凋亡率高于rapamycin组和PD98059组(P<0.01)。结论:1.PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌SGC-7901细胞中处于激活状态,这两条信号通路的异常改变与肿瘤的发生、发展密切相关。2.mTOR靶向抑制剂rapamycin对PI3K/AKT/mTOR信号通路关键基因的转录和翻译过程有抑制作用,并抑制了胃癌细胞的增殖活性,将细胞周期阻滞于G0/G1期,引起细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞的生长,揭示了 P13K/AKT/mTOR信号通路与胃癌化疗效果的相关性。3.MEK靶向抑制剂PD98059可以通过抑制MAPK/ERK信号通路影响细胞的生物学活性,抑制胃癌细胞增殖,使细胞发生G0/G1期阻滞,并促进细胞凋亡,最终使胃癌细胞的生长受到抑制。说明MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059可以作为有效的抗癌药物应用于临床。深入研究MAPK/ERK信号通路在肿瘤发生发展中作用的异常激活,既可以加深对肿瘤发生发展的认识,也可为胃癌的临床治疗提供新靶点、新思路。4.联合运用mTOR抑制剂rapamycin和MEK抑制剂PD98059相比单独用药能更显著的抑制细胞关键基因的转录和翻译过程,并促进细胞凋亡及细胞周期阻滞,从而抑制细胞生长。联合运用多靶点抑制剂可能成为耐药胃癌患者治疗的新方向,本实验为临床研究新的靶向治疗药物及寻求新的联合治疗方案提供了实验依据。