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目的:观察揉髌手法对兔膝关节骨关节炎骨内高压模型血清代谢组学的影响,拟使用核磁共振氢谱(1HNMR)技术,通过检测和动态分析兔膝关节骨关节炎模型的代谢组学特征及手法干预的作用机制,发现与膝关节骨关节炎相关的代谢标记物等信息及变化的内在联系。 方法:六月龄新西兰兔40只,不论雌雄,体重约在2.5 kg~3kg之间,随机分为揉髌手法组(手法组)、模型对照组(模型组)、假模组、正常对照组(正常组),每组10只。采用结扎右侧臀下静脉、股静脉和大隐静脉,造成右膝骨内高压,进而影响膝关节软骨组织代谢而加速软骨组织退变形成骨关节炎动物模型,建模1周后,手法组采用“揉髌手法”治疗,1只/次揉髌手法治疗10分钟,隔日一次,持续治疗5星期共17次。模型组、假模组及正常组均不采用任何措施处理。造模后1、3、5、7周末,所有动物行兔耳静脉采血,量大约2ml,离心吸取上层血清保存于-80℃的冰箱中,等待进行1HNMR检测,建模后第十二周末利用耳缘静脉空气栓塞法处死所有动物,切开兔右膝关节腔进行解剖,用眼观察膝关节关节软骨组织的大体形态变化,然后用咬骨钳取右膝关节内侧胫骨平台软骨组织,放入4%多聚甲醛溶液中备检,行关节软骨HE染色、甲苯胺蓝染色,并进行Mankins分级评分,比较各组间的差异。收集的血清通过1HNMR检测后,用软件SIMCA-P13.0(Umetrics,Umca,Sweden)进行PCA(主成分)分析。 结果:大体观察:手法组及假模组:关节面光整平滑,透明度略低,有光泽,未见明显缺陷和新的生物。造模组:关节面粗糙,软骨面呈现灰黄色,透明度和光泽异常,呈现出明显缺损和骨赘生成。正常组:关节面光整平滑,边缘整齐,软骨透明,有光泽,无缺陷和新的生物。光镜下观察关节软骨组织的改变(组织病理学观察)手法组与假模组:大多软骨表面光整平滑,可见小地方的裂隙,裂隙大多达移行层,四层结构尚清晰。关节软骨层厚度增加,增多的表、中层细胞排列稍紊乱。潮线存在,但部分稍模糊或见多重潮线。部分动物甲苯胺蓝染色轻度减退。模型组:软骨表面局部凹凸不平,裂隙易见,并可见深达辐射层的糜烂及缺损,四层正常结构消失。软骨层明显变薄,软骨细胞变少,大小不一,排列无规律。潮线变形无规律,软骨下血管侵入潮线。大部分动物甲苯胺蓝染色中度减退。个别动物重度减退。正常组:软骨表面光整平滑,四层结构(表、中层、柱状细胞层和钙化层)清晰。细胞大小相同,排列有序。潮线完美清楚。甲苯胺蓝染色无减退。Mankins评分明显下降,光镜发现,手法组关节软骨细胞的形态,结构、布置接近正常组,较模型组和假模组优秀。手法组与模型组从第一次抽血到第四次抽血在PCA的得分图上逐渐能分离,说明手法组到第三周后与模型组有差异。手法组与正常组两组在第一、二次抽血检测中分离,各组各自聚集,第三、四次抽血检测中,手法组和正常组无明显的分离,说明运用手法治疗后,手法组到第三、四次抽血时与正常组无明显的分离,两组无差异。模型组与正常组从第一次抽血到第四次抽血都有较明显的分离,说明模型组与正常组一直都有差异。 结论:(1).通过结扎动物右侧臀下静脉、股静脉和大隐静脉,造成右膝骨内高压,进而影响膝关节软骨组织代谢而加速软骨组织退变形成骨关节炎动物模型,本实验结果证明动物建模是成功的。(2).核磁共振氢谱(1HNMR)技术检测结果显示:揉髌手法可影响兔膝关节骨关节炎血清代谢组学的主要成分,可能是揉髌手法延缓动物关节软骨退变的可能作用机制之一,通过代谢组学可知揉髌手法可防治膝OA。