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目的:研究静脉注射脑红蛋白(Neuroglobin,Ngb)转染脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)联合瑞格列奈对大鼠脊髓损伤的疗效,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:1.取3月龄的健康SD大鼠一只,从腹股沟区脂肪组织中提取ADSCs,细胞传代培养至第三代,流式细胞仪检测传代细胞表面抗原,鉴定为ADSCs后浓缩冻存。将Ngb通过聚合酶链反应(PCR)扩增,与慢病毒载体pLenti6.3-IRES—EGFP成功连接,再转染293T细胞,最后将病毒液转染ADSCs。荧光显微镜检测GFP的表达,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测ADSCs中Ngb表达;用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)标记Ngb成功转染的AD SCs,检测ADSCs的移植效率及存活率。2.采用改良Allen?s法建立大鼠脊髓损伤模型48只,随机分为空白对照组、瑞格列奈组、转染干细胞组、转染干细胞+瑞格列奈(即联合组)。转染干细胞组、联合组均分别静脉注射0.3ml SPIONs标记Ngb转染的ADSCs(1×10~7/ml),1次/日,共6d。联合组、瑞格列奈组分别予以瑞格列奈(0.4mg/kg)灌胃,1次/日,共6d。空白对照组注射等量的DMEM培养基。3.各组实验大鼠分别在第1d、3d、5d、1w、2w和4w采用损伤行为学(Basso-Beattie-Bresnaha n,BBB)法对大鼠脊髓损伤程度进行评分,在1w和4w分别行HE染色、透射电镜观察大鼠脊髓病理变化,WB检测脊髓组织Ngb的表达情况。结果:1.ADSCs的提取及鉴定:从SD大鼠腹股沟脂肪组织成功分离出ADSCs,传代培养后经流式细胞学技术检测细胞表面抗原CD49d、CD44的表达分别为47.21%、50.05%,CD14、CD45的表达分别为0.72%、2.57%。2.Ngb的示踪:Ngb转染的ADSCs培养至第3天时发现有明显GFP表达,采用培养后5天的Ngb转染的ADSCs进行动物实验,在第1W,第2W及第4W转染干细胞组大鼠脊髓组织内均检测到GFP的表达,提示Ngb在脊髓损伤部位有表达,且随时间的延长表达逐渐增多。3.SPIONs标记的ADSCs存活率检测结果:SPIONs标记的ADSCs组第1d、第3d、第5d存活率分别为96.12±0.75%、95.35±1.24%、95.61±1.35%,未被SPIONs标记的ADSCs组第1d、第3d、第5d存活率分别为95.43±1.12%、96.45±1.70%、96.10±0.12%,两组无统计学差异(P>0.05)。4.BBB评分:造模后3d各组大鼠BBB评分均在0-2分,四组两两比较,差异无统计学意义(P>0.05),提示造模成功;造模后5d、7d、14d、28d四组大鼠BBB评分趋势始终为:空白对照组低于瑞格列奈组,瑞格列奈组低于转染干细胞组,联合组最高,四组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5.HE染色结果:第1w时各组大鼠脊髓组织中均出现不同程度的炎症细胞及成纤维细胞浸润、组织紊乱、神经细胞空泡样变及残留组织间隔增大等改变,其中空白对照组最为明显,瑞格列奈组炎症细胞浸润相对较少,神经元空泡样变数量较少,转染干细胞组及联合组的病理改变最少;第4w时各组大鼠脊髓组织出现不同程度组织排列紊乱、胶质瘢痕形成、神经元空泡样变,空白对照组比瑞格列奈组明显,瑞格列奈组比转染干细胞组明显,联合组改变最少。6.电镜结果:第1w时各组大鼠脊髓组织中神经髓鞘结构水肿粘连、突触间隙增大及神经突触减少等改变。第4w时神经组织脱髓鞘病变加重、部分髓鞘消失、出现神经元细胞溶解及胶质细胞数量增多等改变,以上两个时间点的观察结果显示空白对照组改变比瑞格列奈组明显,瑞格列奈组改变比转染干细胞明显,联合组改变最少。7.WB检测Ngb结果:空白对照组、瑞格列奈组、转染干细胞组及联合组第1w时Ngb表达量分别为0.08±0.04、0.09±0.03、0.41±0.10、0.45±0.09,第4w时Ngb表达量分别为0.12±0.04、0.15±0.02、0.61±0.08、0.72±0.12,两个时间点空白对照组和瑞格列奈组与联合组比较,差异有统计学意义(P<0.05),联合组Ngb表达量最多,神经功能恢复最好。结论:静脉注射Ngb转染的ADSCs能靶向迁移到脊髓损伤部位,并且对大鼠脊髓损伤具有一定疗效,联合瑞格列奈治疗效果更加明显。