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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知功能减退为主要临床表现的神经退行性脑部疾病,随病情进展,可表现为精神症状和行为障碍、继而导致日常生活能力下降乃至丧失。白藜芦醇(resveratrol,RES),是一类主要存在于花生和虎杖中的多酚类化合物,具有广泛的抗炎、抗氧化、抗衰老、保护心脏、抗肿瘤、免疫调节和神经保护等多种生物学活性。本课题组前期研究结果表明,RES可通过抗氧化、干扰β淀粉样蛋白聚集、调节下丘脑-垂体-肾上腺轴活性等多种途径参与多种疾病状态下的异常神经精神行为调节。本研究拟通过双侧海马定位注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)构建小鼠AD模型,采用多种行为学方法观察RES对AD模型小鼠的感觉、运动、情感及学习记忆能力的影响,并检测胰岛素及nesfatin-1血清浓度,同时观察海马胶质细胞激活及海马和前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)突触可塑性调节相关分子的表达改变,以期探索RES对AD的潜在治疗作用及可能机制。目的通过双侧海马定位注射STZ构建AD小鼠模型,观察神经精神行为的变化,检测胰岛素及nesfatin-1血清浓度、观察海马胶质细胞激活以及海马和PFC突触可塑性调节相关分子的表达改变,在此基础上探索RES的保护作用及可能作用机制。方法1.建立AD小鼠模型,观察小鼠的神经精神行为改变,检测胰岛素及nesfatin-1血清浓度、观察海马胶质细胞激活以及海马和PFC突触可塑性调节相关分子的表达改变26只雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组和模型组。模型组小鼠双侧海马定位注射STZ溶液(3 mg/kg)建立AD模型,对照组给予等量生理盐水。每周测量体重一次,两周后采用转棒试验(rotarod test,RT)、旷场试验(open field test,OFT)、糖水偏爱实验(sucrose preference test,SPT)、悬尾试验(tail suspension test,TST)、新物体识别试验(novel object recognition test,NOR)、空间恐惧记忆实验(contextual fear conditioning test,CFC)和Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)来评估神经精神行为。末次行为学实验结束后立即采集脑组织和血液标本。酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清胰岛素浓度。脑组织切片进行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),钙离子结合调节因子(ionized calcium-binding adapter molecule1,Iba-1),双皮质激素(doublecortin,DCX)及CD68的免疫组化染色。蛋白免疫印迹技术(western blotting,WB)观察海马和PFC中N-甲基-D-天冬氨酸受体2A(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR2A),NMDAR2B,突触Ras-GTP酶激活蛋白(Synaptic Ras GTPase activating protein,Syn GAP),突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95),脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF),糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β),β-连环素(β-catenin),p-β-catenin,p-GSK-3β(ser9),Cyclin D1,Synaptotagmin-1及Synaptophysin的蛋白表达。2.RES对AD小鼠胰岛素代谢紊乱和神经精神损伤的保护作用及机制研究取雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组、模型组、RES组(25 mg/kg)、阳性药西格列汀组(15 mg/kg)和多奈哌齐组(1.5 mg/kg),每组13只。每周测量体重一次。按照第一部分方法建立模型后,连续给药5周。给药一周后进行行为学测试,包括RT,OFT,SPT,TST,NOR,CFC及MWM实验,ELISA法检测血清胰岛素及Nesfatin-1的含量,实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,RT-PCR)法检测海马及PFC中Nesfatin-1 m RNA的含量,WB法检测小鼠海马和前额叶皮层中Syn GAP,PSD95,Synaspin-1,Synaptophysin,BDNF,p-GSK-3β(ser9)及GSK-3β的表达。结果1.与对照组相比,双侧海马STZ注射的模型组小鼠表现出体重增加减缓、血清胰岛素浓度升高;海马组织中小胶质细胞和星型胶质细胞呈注射部位聚集性分布,且活化小胶质细胞数量明显增加,提示模型组小鼠神经免疫系统的激活;行为学结果表明模型组小鼠在OFT中的运动总距离、中央区域探索时间及运动距离均显著下降,在NOR中新物体识别指数显著下降,同时在MWM定位航行实验中逃生潜伏期延长,空间搜索实验中运动至原平台总距离增加、目标象限停留时间及进入频率均减少,提示模型组小鼠存在探究性活动降低、学习记忆能力下降等精神神经行为异常。WB结果表明模型组小鼠海马及PFC中NMDAR2A,NMDAR-2B,Syn GAP,PSD95,BDNF及p-β-catenin/β-catenin的相对蛋白表达量降低,而p-GSK-3β(ser9)/GSK-3β的相对表达量仅在海马中下调。2.与AD小鼠比较,RES(25 mg/kg)灌胃给药可加快AD小鼠的体重增长但对整体体重并无显著影响,显著降低小鼠血清胰岛素浓度。行为学结果表明,RES(25 mg/kg)灌胃给药可明显缩短AD小鼠在OFT中的中央区运动时间,增加在NOR中的新物体识别指数,缩短AD小鼠在MWM定位航行实验中的逃生潜伏期。WB结果表明,RES(25 mg/kg)灌胃给药可上调小鼠海马中Nesfatin-1、Syn GAP、PSD95的蛋白表达及GSK-3β的磷酸化。结论1.小鼠双侧海马定位注射STZ可成功诱导AD模型,具体表现为探索性行为减少及学习认知记忆能力减退。其机制可能与血清胰岛素浓度上升,脑内炎症反应激活有关,并且海马和PFC中涉及突触可塑性调节的NMDAR2A,NMDAR2B,Syn GAP,PSD95和BDNF蛋白表达下调及Wnt/β-catenin信号转导通路关键蛋白表达失衡可能参与其中。2.RES可改善海马定位注射STZ诱导的AD小鼠学习记忆功能障碍,其机制可能与改善外周胰岛素代谢、调节海马中突触可塑性相关蛋白Syn GAP和PSD95表达、调节Wnt通路中GSK-3β的磷酸化以及Nesfatin-1的丰度有关。