副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,H.parasuis）引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎。多年来,该病的流行给我国及世界养猪业带来严重的经济损失。OxyR调控蛋白属于LysR转录调节因子家族的成员,在细菌抗氧化防御系统中发挥关键作用,该调控子也被认为与多种细菌毒力因子的调控相关。至今,对H.parasuis抗氧化相关的研究报道很少,对H.parasuis中oxyR基因的研究未见报道。本研究在本实验室对H.parasuis血清11型SC1401菌株全基因组测序的基础上,构建了oxyR基因缺失株（H.parasuis SC1401?oxyR）和回补株（H.parasuis SC1401?oxyR pLS88::oxyR）,并分析其生物学表型;通过全局性比较转录组学和蛋白组学研究分析,进一步鉴定出与H.parasuis氧化应激相关的若干重要基因和重要蛋白,为阐明oxyR在H.parasuis致病过程中的作用和抗氧化应激的分子调控机制提供了科学的依据,对该病防控手段提供了新的有价值的信息。一、副猪嗜血杆菌oxyR基因缺失株的构建以H.parasuis SC1401菌株为亲本株,通过融合PCR将oxyR基因上游片段（U）、Kan基因片段（K）和oxyR基因下游片段（D）融合得到片段（UKD）;将UKD插入到pK18mobsacB载体中,得到重组载体UKD-pK18;利用自然转化方法将重组载体UKD-pK18转入H.parasuis SC1401菌株中,挑单菌落并经PCR和Western Blot鉴定后,获得oxyR基因缺失株（H.parasuis SC1401?oxyR）。对oxyR基因的完整开放阅读框（ORF）进行PCR扩增,得到完整的oxyR片段;将oxyR片段与“穿梭”质粒pLS88连接,得到回补质粒pLS88::oxyR,并电转化到oxyR基因缺失株（H.parasuis SC1401?oxyR）,经PCR和Western Blot鉴定,得到回补株（H.parasuis SC1401?oxyR pLS88::oxyR）。二、副猪嗜血杆菌oxyR基因缺失株的生物学特性研究对H.parasuis SC1401、H.parasuis SC1401?oxyR和H.parasuis SC1401?oxyR pLS88::oxyR分别经革兰氏染色镜检,发现菌体形态差异不显著;生长曲线测得12h时H.parasuis SC1401的OD₆₀₀为1.68,H.parasuis SC1401?oxyR的OD₆₀₀为0.31,H.parasuis SC1401?oxyR pLS88::oxyR的OD₆₀₀为1.44,证明oxyR的缺失导致H.parasuis出现显著的生长缺陷,而当oxyR基因在H.parasuis SC1401?oxyR中回补成功后,该生长缺陷得到修复;氧化应激抗性实验发现,在不同的H₂O₂浓度作用下,H.parasuis SC1401?oxyR的抑菌环均大于H.parasuis SC1401和H.parasuis SC1401?oxyR pLS88::oxyR,表明H.parasuis SC1401?oxyR对H₂O₂比H.parasuis SC1401更敏感;生物被膜形成实验测得H.parasuis SC1401形成生物被膜的量OD₆₀₀为0.520,H.parasuis SC1401?oxyR形成生物被膜的量OD₆₀₀为0.245,H.parasuis SC1401?oxyR pLS88::oxyR形成生物被膜的量OD₆₀₀为0.466,说明oxyR基因对H.parasuis生物被膜的形成具有促进作用;攻毒小鼠组织病理学分析,发现亲本株在小鼠的肺、肝、脑、脾均形成不同症状的明显病变,而oxyR基因缺失后各组织病变均明显减轻甚至无病变,说明oxyR与H.parasuis毒力相关。三、副猪嗜血杆菌亲本株和oxyR基因缺失株比较转录组学研究应用RNA-seq技术对H.parasuis SC1401和H.parasuis SC1401?oxyR进行全局性比较转录组学研究,发现H.parasuis的oxyR基因缺失后,差异表达基因（DEGs）为466个（占全基因组的20.86%）,其中,上调表达240个,下调表达226个。这些DEGs的功能主要有转录调控、DNA的复制重组和修复以及氧化应激等。对这些DEGs进行GO注释,发现主要有有机环状化合物生物合成过程、杂环生物合成过程、芳香族化合物生物合成过程和氧化还原过程。对这些DEGs进行KEGG通路分析,发现主要有次生代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、ABC转运体和碳素代谢。这些结果表明,H.parasuis的oxyR基因的缺失,对H.parasuis具有整体性的调控作用。四、副猪嗜血杆菌亲本株和oxyR基因缺失株比较蛋白组学研究通过iTRAQ定量蛋白质组测序分析技术,对H.parasuis SC1401和H.parasuis SC1401?oxyR进行了比较蛋白组学分析,发现H.parasuis的oxyR基因缺失后,差异表达蛋白（DEPs）为45个,其中14个上调,主要有溶原化蛋白HflD、ABC转运体底物结合蛋白和DNA重组修复蛋白RecA等;31个下调,主要有ABC转运蛋白通透酶、硝酸还原酶催化亚基和铁硫簇支架蛋白IscU等。对这些DEPs进行GO富集和KEGG富集分析,发现主要与碳水化合物代谢、三羧酸循环、细胞信号转导以及细菌致病性相关。以上转录组学和蛋白质组学研究结果的比较关联性分析,发现二者表达量Pearson相关系数为0.261,相关性较低。但发现有18个转录本在转录组和蛋白质组中为显著差异表达,对应的基因功能主要为碳代谢、同源重组和ABC转运体等。综上,本研究首次构建出H.parasuis的oxyR基因缺失株,分别对oxyR基因缺失株和亲本株进行了一系列生物学特性实验,以及比较转录组学和比较蛋白组学等较为系统的分析,发现了较为广泛的差异表达基因和差异表达蛋白,为进一步解释H.parasuis的oxyR基因缺失后生物学特性变化的成因,以及为研究oxyR基因功能和分子调控相关的H.parasuis致病机制提供了科学的依据和有价值的信息。