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分子伴侣广泛存在于各种生物细胞中,可有效的促进蛋白质的正确折叠、抑制变性蛋白聚集体的形成。近年来,由于分子伴侣在细胞生命活动的各个层次上所起的重要作用,引起了科学家的广泛关注。
硫矿硫化叶菌(Sul folobus sol fataricus)P2是一种极端嗜热古菌,它的最适生长温度为80℃,是目前嗜热古菌研究的一个模式菌株,该菌株全基因组测序工作已经完成。从该菌基因组分析中已经推测出了分子伴侣可能的序列,但是到目前为止,在国内外尚未见硫矿硫化叶菌P2分子伴侣克隆表达及性质研究方面的相关报道。
本研究根据Genbank上报道的硫矿硫化叶菌P2的分子伴侣序列设计引物,利用PCR技术从硫矿硫化叶菌P2的基因组DNA中克隆得到分子伴侣α、β、γ亚基的基因。将三个基因分别克隆到表达载体pET-21a(+)上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达。在此基础上,对β亚基的性质与功能进行进一步的研究。
硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基表达工程菌,经发酵诱导表达后,所收集的菌体用超声波破碎。破碎后的菌液经75℃高湿处理30 min去除杂蛋白,再经(NH4)2SO4沉淀以及Sephacryl S-200柱层析后,得到了β亚基的单体。
纯化后的β亚基单体,在ATP和Mg2+存在的条件下可自组装形成分子伴侣聚合体。透射电镜观察表明:这些大分子复合物是环状的八聚体(每个环由八个亚基组成,整个分子是十六聚体),展现了分子伴侣典型的双层面包圈的结构特征。
该分子伴侣β亚基体外同源聚合体(β分子伴侣)具有ATPase活性,最适反应温度为80℃。以维多利亚水母(Aeguorea victoria)来源的绿色荧光蛋白(GFP)为研究对象,分析该β分子伴侣对变性蛋白重新折叠的促进作用,结果表明该分子伴侣对外源GFP的复性具有明显的促进作用。以橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceovlridls)来源的木聚糖酶为研究对象,分析该β分子伴侣对外源蛋白热稳定性的影响,结果表明该分子伴侣能够有效的提高木聚糖酶的热稳定性。
本研究表明:硫矿硫化叶菌P2的β分子伴侣不仅具有II型分子伴侣典型的双层面包圈结构,而且具备该型分子伴侣的基本功能,能够帮助其它蛋白进行快速有效的正确折叠,维持蛋白质在高温条件下的结构稳定性,保障这些蛋白的功能得到正常的发挥。研究推测该分子伴侣对于硫矿硫化叶菌P2耐高温的热适应机制有着重要的贡献。这些结果为进一步深入研究嗜热古菌分子伴侣的性质及生物学功能以及嗜热古菌耐热抗逆的分子机制,奠定了良好的基础。