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目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种可定植于人胃黏膜的革兰阴性微需氧菌。H.pylori感染是导致慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等胃肠道疾病发生的重要病因。作为H.pylori高度保守的毒力岛,cag致病岛（cag pathogenicity island,cag PAI）编码了H.pylori重要毒力蛋白CagA以及负责转运递送CagA的Ⅳ型分泌系统（type IV secretion system,T4SS）,这些cag PAI编码的毒力因子表达受转录调控蛋白的调控,与消化系统疾病的发生发展密切相关。由于H.pylori的基因组相对较小,目前已知的转录调控蛋白包含Rpo D、Rpo N、Fli A、Hrc A、Ars R、HP0222、HP0564、Flg R、Hup、HP1021、Hsp R、Fur、Hsr A、Che Y、Nik R、Crd R共16个。然而迄今为止对H.pylori毒力调控的研究报道甚少,鉴于此,本课题组团队对16个H.pylori调控蛋白的调控作用及其机制开展了研究。本项目对其中5种调控蛋白,即HP1021、Hsr A（HP1043）、Ars R（HP0166）、Nik R（HP1338）、HP0222进行研究。首先克隆表达该5种调控蛋白,筛选与CagA及T4SS组分上游启动子序列结合的蛋白,在此基础上进一步研究该转录调控蛋白对H.pylori毒力因子CagA及T4SS表达的影响,旨在揭示H.pylori中调控相关毒力表达的调控因子,为治疗与H.pylori感染相关的新药靶点研发提供线索。方法:1.转录调控蛋白重组质粒的构建,表达及纯化1.1转录调控蛋白重组质粒的构建通过NCBI获取H.pylori NCTC26695基因组序列,PCR扩增调控蛋白hp1021、hp1043、hp0166、hp1338、hp0222基因编码区序列,与双酶切线性化后的p ASK-IBA7plus载体片段连接构建转录调控蛋白重组质粒,转化大肠杆菌BL21并进行amp抗性筛选。通过菌落PCR及DNA测序验证转化子插入片段的准确性。1.2转录调控蛋白的表达纯化将构建成功的重组质粒利用四环素诱导表达带有Strep标签的目的蛋白,通过Strep-Tactin纯化柱进行纯化并通过SDS-PAGE验证调控蛋白的分子量大小。2.结合CagA和T4SS重要基因启动子的调控蛋白筛查2.1与CagA启动子序列结合的调控蛋白筛查选取CagA上游200bp启动子序列片段,PCR扩增后连接至p LB载体质粒,通过带有Alexa Fluor 700荧光标记的通用引物PCR扩增获得CagA启动子探针“promoter-cag A”。将已表达的五个调控蛋白分别与CagA启动子探针于37℃下共同孵育,通过凝胶迁移实验（EMSA）筛选能够与探针发生结合的调控蛋白。2.2 HP0222可结合T4SS重要基因启动子选取T4SS重要组分上游200bp启动子序列片段,PCR扩增后连接至p LB载体质粒,通过带有Alexa Fluor 700荧光标记的通用引物PCR扩增获得T4SS启动子探针“promoter-cag1”、“promoter-cag U”、“promoter-cag Z”、“promoter-cag L”、“promoter-cag X”。将调控蛋白HP0222与T4SS启动子探针于37℃下共同孵育,通过凝胶迁移实验（EMSA）研究其结合能力。2.3 HP0222序列BLAST分析利用NCBI序列数据库蛋白BLAST模块比对HP0222（Gen Bank:AAD07296.1）与其他蛋白间的同源性（除螺杆菌属）,以预测HP0222生物学相关功能。3.H.pylori NCTC26695Δhp0222的构建3.1重组质粒“p Bluescript SK II（-）-hp0222上游臂-kana R-hp0222下游臂”的构建根据同源重组原理设计hp0222基因突变载体。PCR扩增hp0222基因上游臂及下游臂片段,以卡那霉素抗性基因（kana R）为筛选抗性,穿梭质粒p Bluescript SK II（-）为载体质粒,通过多片段连接重组酶构建“p Bluescript SK II（-）-hp0222上游臂-kana R-hp0222下游臂”重组质粒,转化大肠杆菌DH5α并进行kana抗性筛选。通过菌落PCR及DNA测序验证转化子插入片段的准确性。3.2 NCTC26695Δhp0222的构建将成功构建的重组质粒通过电穿孔转化至NCTC26695,于含kana的哥伦比亚血平板上培养筛选。提取传代培养后的细菌基因组DNA并验证。4.HP0222对cag PAI编码基因表达的调控作用4.1 HP0222对CagA表达的影响取处于对数生长期的NCTC26695及NCTC26695Δhp0222。提取细菌RNA并通过qPCR检测cag A基因在转录水平的表达。超声裂解提取细菌蛋白,通过Western blot检测CagA在蛋白水平的表达。4.2 HP0222对T4SS表达的影响提取处于对数生长期的NCTC26695及NCTC26695Δhp0222细菌RNA,选取T4SS基因cag1（hp0520）、cag C（hp0546）、cag F（hp0543）、cag M（hp0537）、cag P（hp0536）、cag Q（hp0535）、cag S（hp0534）、cag U（hp0531）、cag V（hp0530）、cag L（hp0539）,通过qPCR检测T4SS所有操纵子在转录水平的表达。4.3 HP0222对H.pylori感染AGS细胞后CagA表达的影响取处于对数生长期的NCTC26695Δhp0222及NCTC26695,分别于无血清的细胞培养基中适应4h后感染AGS细胞,感染9h后提取总蛋白,通过Western blot检测感染细胞后的CagA及磷酸化CagA水平。5.统计学方法采用SPSS 22.0进行配对样本T检验进行数据分析。结果:1.转录调控蛋白重组质粒的构建,表达及纯化1.1转录调控蛋白重组质粒的构建DNA凝胶电泳结果显示,扩增片段与目的片段大小一致,且DNA测序结果证实目的片段无突变位点,成功构建转录调控蛋白重组质粒。1.2转录调控蛋白的表达纯化SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果显示,纯化后的蛋白分子量与目标蛋白大小一致。成功表达带有Strep标签的五种转录调控蛋白。2.结合CagA和T4SS重要基因启动子的调控蛋白筛查2.1与CagA启动子序列结合的调控蛋白筛查EMSA结果显示,功能已知的调控蛋白HP1021和功能未知的调控蛋白HP0222均具有结合CagA上游启动子序列的能力。本课题选定功能未知的HP0222作为研究对象,进一步研究其与T4SS重要基因启动子的结合能力。2.2 HP0222可结合T4SS重要基因启动子EMSA结果显示,HP0222具有结合T4SS重要基因启动子的能力,提示HP0222具有调控CagA及T4SS表达的作用。2.3 HP0222序列BLAST分析BLAST分析显示,HP0222与除螺杆菌属外的蛋白之间不存在同源。3.H.pylori NCTC26695Δhp0222的构建3.1重组质粒“p Bluescript SK II（-）-hp0222上游臂-kana R-hp0222下游臂”的构建DNA凝胶电泳验证结果显示,扩增片段与目的片段大小一致,且DNA测序结果证实目的片段无突变位点,成功构建转录重组质粒“p Bluescript SK II（-）-hp0222上游臂-kana R-hp0222下游臂”。3.2 NCTC26695Δhp0222的构建DNA凝胶电泳验证结果显示,靶基因hp0222被kana R成功替换,成功构建基因突变株NCTC26695Δhp0222。4.HP0222对cag PAI编码基因表达的调控作用4.1 HP0222对CagA表达的影响qPCR结果显示,相比于NCTC26695,NCTC26695Δhp0222中cag A基因在转录水平的表达升高了1.489±0.186倍。Western blot结果显示,相比于NCTC26695,NCTC26695Δhp0222中CagA在蛋白水平的表达升高了1.498±0.099倍。4.2 HP0222对T4SS表达的影响qPCR结果显示,相比于NCTC26695,NCTC26695Δhp0222中T4SS组分基因cag M（hp0537）、cag S（hp0534）、cag V（hp0530）、cag L（hp0539）在转录水平的表达分别上调了1.766±0.103,1.417±0.173,1.271±0.166,1.836±0.157倍。4.3 HP0222对H.pylori感染AGS细胞后CagA表达的影响Western blot结果显示,在细胞水平上,相比于NCTC26695,NCTC26695Δhp0222感染AGS细胞后CagA蛋白的表达量升高了3.526±0.834倍,转运至胞内的磷酸化CagA水平升高了3.534±1.045倍。结论:1.HP0222具有结合CagA启动子及T4SS重要基因启动子“promoter-cag1”、“promoter-cag U”、“promoter-cag Z”、“promoter-cag L”、“promoter-cag X”的能力2.HP0222抑制CagA及T4SS组分Cag M、Cag S、Cag V、Cag L的表达3.HP0222抑制H.pylori感染AGS细胞后CagA的表达以及磷酸化CagA水平