论文部分内容阅读
本研究以不同类型马为研究对象,利用PCR技术,首次克隆了6个类型马包括完整4个外显子和3个内含子的多巴胺D4受体基因。其中三河马的序列提交到了GenBank,登录号为:EF561289。此外,对6个类型马的多巴胺D4受体基因序列结构、核苷酸组成及所编码的氨基酸进行了初步研究,并利用生物信息学方法对马DRD4蛋白结构、功能位点等进行分析预测,同时采用PCR-SSCP技术、PCR-RFLP技术和PCR产物纯化直接测序等方法对各类群马DRD4基因序列进行了多态性分析。研究结果表明:1、马DRD4基因含有4个外显子和3个内含子,且不同类型马第2外显子、第3外显子和第1内含子的大小存在差异。2、马DRD4基因序列核苷酸组成富含GC,且外显子GC含量明显高于内含子区域和全序列。马与其它物种的DRD4基因密码子3个位点核苷酸均偏向使用G和C。3、马DRD4基因编码区对同义密码子的使用表现有强烈的偏好性。4、马DRD4基因所编码的20种氨基酸的含量差异很大。丙氨酸(A)含量最高,为15.65%;赖氨酸(K)最低,为0.88%。非极性氨基酸含量(57.34%)高于极性氨基酸(42.66%)。5、马DRD4蛋白结构预测结果表明,一级结构由30个氨基酸组成的细胞外N-末端、7个α螺旋的跨膜结构、3个胞内环、3个胞外环和由17个氨基酸组成且位于胞内的C末端。在二级结构中发现,在不同类型马DRD4蛋白中至少形成约12个α-螺旋、8个β-折叠、40个loop结构,含18个功能位点、7个低复杂区(LCRs)、一个不规则区(NORs)和5个二硫键,且其三级结构为一典型的致密桶状结构。6、PCR-SSCP分析结果表明,在所检测的第1、第4外显子及第2、第3内含子区域均较保守,未发现任何多态现象。7、PCR-RFLP分析结果表明,在第1内含子存在一处17bp片断的插入/缺失和一处A→G转换,导致StuI位点出现A、B和C三种等位基因。在该位点,除纯血马以AB型和B为优势基因型和优势等位基因外,其它类群马的优势基因型和优势等位基因均为AA型和A,且巴尔虎马、乌珠穆沁马和乌审马在此位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态;而存在于第1内含子的T→C转换和第2外显子的G的插入/缺失,导致StyI位点出现D、E和F三种等位基因,且G的插入/缺失引起了移码突变。该位点除纯血马的优势基因型和优势等位基因为DD型和D外,其余类群马均为EE型和E,且巴尔虎马和乌审马在此位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。8、不同类群马DRD4基因各位点纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)及多态信息含量(PIC)分析表明:StuI位点,纯血马、三河马和巴尔虎马为高度多态(P>0.5),其余均为中度多态;StyI位点,乌审马和乌珠穆沁马为中度多态,其余均为高度多态。9、通过对不同类型马第3外显子的44条序列比对结果发现,共有40个核苷酸位点发生变异,有24种单倍型,26个单一多态位点,14个简约信息位点;此位点的变异类型有转换、颠换和VNTR三种,其中转换占绝对优势;24种单倍型的氨基酸序列比对发现,有20种不同的氨基酸序列,且部分氨基酸变异引起了二级结构的改变。