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大薯(Dioscoreaalata L.)在我国有着传统的栽培历史,长江以南地区均有种植,是一种具有特色的药食兼用的传统蔬菜。炭疽病是大薯生产中最严重的病害之一,目前还没有很好的防治方法,发掘和筛选有效的内源抗性基因进行分子抗病机理的研究,可以为今后大薯抗病育种的研究提供科学依据和理论参考。基于前期工作基础,本研究采用前期鉴定的海南优势炭疽菌株(Colletotrichum asianum)接种2份抗感差异明显的大薯种质,并采用透射电镜技术探究抗感种质在炭疽菌侵染后的超微结构变化;同时,基于前期的转录组数据,利用qRT-PCR对15个与防卫反应相关的差异表达基因进行分析,并克隆了DaPR 基因和2个WRKY基因的cDNA全长,通过酵母单杂技术分析DaPR1基因启动子和2个WRKY转录因子间的互作关系。主要研究结果如下:1.对大薯高感种质Da90和高抗种质Da94分别接种炭疽菌后72h、96h和120h叶片细胞超微结构的变化进行观察并分析。结果发现:Da90接种炭疽菌72h后叶片细胞出现异常,叶绿体淀粉粒变大、嗜锇颗粒增多,部分细胞出现质壁分离,叶绿体降解等现象;接种炭疽菌96h后,叶片细胞内出现初生菌丝,叶绿体和线粒体出现解体;接种炭疽菌120h后,叶片细胞内和细胞间隙出现次生菌丝,标志着炭疽菌开始由活体营养阶段转向死体营养阶段。而Da94接种炭疽菌72h和96h后叶片细胞均基本正常,120h后部分细胞出现质壁分离,细胞膜边缘出现大量囊泡,叶绿体中淀粉粒增多变大,其他细胞器结构正常,并未观察到菌丝。这一结果表明可能是高抗种质Da94产生了某种物质或结构影响了炭疽菌菌丝的成,导致无法完成对寄主的侵染致病。2.筛选得到15个与防卫反应相关的差异表达基因进行荧光定量PCR分析,在炭疽菌的诱导下15个基因的表达量均高于对照,但是不同基因在抗感种质中表达量的变化有所不同。其中,GST、SOD、CHI2、CHI5、WRKY33和PR1在炭疽菌侵染抗病材料后表达量显著提高,表明这7个特异表达的基因可能与炭疽病抗性相关。3.利用RT-PCR技术从大薯中克隆了DaPR1、DaWRKY28、DaWRKY 3基因的全长cDNA。生物信息学分析表明DaPR1编码的蛋白具有典型SCP-PRl-like保守结构域,Blast 比对表明 DaPRl 蛋白与油棕(Elaeisguineensis)、海枣(Phhoenix dactylifera)、香蕉(Musa acuminata)和芦笋(Asparagus officinalis的 PR1 蛋白同源性较高,分别为79%、76%、75%、74%。同时,分析显示,DaWRKY28和DaWRKY33基因编码的氨基酸序列均包含1个WRKY结构域且C端具有1个锌指序列结构C2H2,因此可以判定这2个WRKY转录因子均属于WRKY转录因子家族中的第Ⅱ类。构建系统发育树结果显示,DaWRKY28与油棕(EgWRKY28)和海枣(PdWRKY28)的转录因子聚为一类,亲缘关系较近;而DaWRKY33与陆地棉(GhWRKY9)的转录因子聚为一类,亲缘关系较近。4.利用Adaptor-PCR方法分别构建了大薯Da90和Da94的启动子克隆文库。通过巢式PCR扩增DaPR1上游转录调控序列,最终在Da90启动子克隆文库中获得了长度为1526bp的DaPR 启动子序列(PPRla),在Da94启动子克隆文库中获得了长度为1336bp的DaPR1启动子序列(PPRlb)。序列分析表明这2个启动子序列除了含有基础的启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还均含有茉莉酸(JA)、赤霉素(GB)等激素响应元件及真菌诱导响应元件(W-box)。5.利用点对点酵母单杂交技术证明了 DaWRKY33转录因子能够与克隆的DaPR1基因的两个启动子互作,从而参与DaPRl基因的表达。而DaWRKY28转录因子不能与DaPR1基因的启动子互作。