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背景:目前,肺腺癌的发病率及死亡率逐渐上升,已取代鳞癌成为最常见的病理类型。虽然化疗仍然是治疗肺癌的重要手段之一,但患者的生存期及预后不理想,所以急需更有效的治疗方法,这就需要我们对于肿瘤的发生发展过程有更为深入的了解,才能从“根源”上解决肺癌的问题。随着干细胞的理论被引入肿瘤研究,提出了肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)假说,认为肿瘤是由一小部分异型性肿瘤细胞不断增殖、自我更新和分化发展而来,是肿瘤侵袭、转移和复发等恶性演变的关键。缺氧微环境是实体肿瘤的典型特征,被认为是导致肿瘤进展及预后差的独立因素;作为CSCs壁龛的关键组成部分,缺氧微环境对CSCs在肿瘤中的演进以及抗凋亡能力起着重要的作用。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)是肿瘤适应缺氧微环境的中心调节因子,介导生理性和病理性的缺氧反应。HIFs作为一个异源二聚体,由氧调节的HIF-α亚基和HIF-β亚基组成。HIF-α又分为3个亚型:HIF-1α,HIF-2α和HIF-3α。在基因序列上HIF-lα和HIF-2α之间具有高度同源性,但他们在肿瘤的进展中各自调节它们独特的靶基因而发挥重要的作用。而HIF-2α是肿瘤干细胞进展的一个主要调节因子,对维持干细胞“干性”特征及抗凋亡能力有着重要的影响。因此,本研究旨在观察在缺氧微环境因素刺激下HIF-2α通过激活Wnt/β-catenin通路,特异性调控OCT-4干细胞标记基因维持A549干细胞球“干性”特征和增强其抗凋亡能力的影响。研究目的:1、探讨缺氧条件下HIF-2α对A549干细胞球“干性”的影响。2、初步探讨缺氧条件下HIF-2α对A549干细胞球抗凋亡的影响。方法:1、通过无血清培养基(serum-free medium,SFM)的方法诱导A549细胞系形成A549细胞球体。2、应用shRNA-HIF-2α干扰慢病毒载体转染A549细胞系和A549干细胞球。3、采用westernblot分别检测a549细胞及a549干细胞球在常氧及缺氧24小时细胞中hif-2α、oct-4以及β-catenin的蛋白表达水平;shrna-hif-2α干扰慢病毒转染之后两组细胞在常氧及缺氧24小时细胞中hif-2α、oct-4以及β-catenin的蛋白表达。4、rt-pcr检测hif-2α、oct-4以及β-catenin基因的表达。5、利用流式细胞术检测在常氧及缺氧24小时两组细胞的凋亡率及胞内ros的浓度。shrna-hif-2α干扰慢病毒转染之后两组细胞在常氧及缺氧24小时细胞中的凋亡率及ros浓度。6、cck-8检测两组细胞在常氧及缺氧条件下细胞增殖情况。结果:1、sfm法培养出的a549干细胞球,倒置相差显微镜下观察结果显示:由20-100个细胞组成的球状细胞团,大小不一,悬浮于sfm培养基中,结构较致密而不易吹散,折光性较强。2、第二代a549干细胞球缺氧24小时观察到组成细胞球的细胞分散悬浮于缺氧液中,但折光性比常氧条件下的强。3、westernblot、rt-pcr检测到:(1)常氧中a549细胞和a549干细胞球中hif-2α蛋白及mrna微表达(p>0.05);(2)缺氧刺激下a549细胞和a549干细胞球hif-2α、oct-4、β-catenin蛋白及mrna的表达均比常氧组显著增高(p<0.05);(3)缺氧刺激下a549干细胞球hif-2α、oct-4、β-catenin蛋白及mrna的表达较a549细胞系增高(p<0.05)。4、shrna-hif-2α干扰慢病毒转染两组细胞之后:(1)a549细胞系和a549干细胞球hif-2α蛋白及mrna水平在常氧和缺氧两组条件下均表达微弱(p<0.05);(2)缺氧刺激下a549细胞系和a549干细胞球oct-4、β-catenin蛋白及mrna表达较常氧组下降或者变化不明显。5、流式细胞技术检测两组细胞凋亡结果显示;缺氧刺激下两组细胞的凋亡率较常氧组的下降(p<0.05);shrna-hif-2α干扰慢病毒转染两组细胞后细胞的凋亡率缺氧组均较常氧组显著增高(p<0.05)。6、流式细胞技术检测ros结果显示:在缺氧刺激下两组细胞的ros浓度水平均比常氧组的下降(p<0.05),且a549干细胞球ros下降更为明显(p<0.05);shrna-hif-2α干扰慢病毒转染后两组细胞的ros浓度缺氧组较常氧组显著增高(p<0.05),且a549干细胞球的ros增高更为明显(p<0.05)。7、CCK-8法检测细胞增殖显示:两组细胞整个观察期间,第16、24、36小时显示:缺氧刺激下较常氧组的增殖水平高(P<0.05),且A549干细胞球增高更为明显(P<0.05)。结论:1、缺氧条件下A549干细胞球HIF-2α及其特异性调控的靶基因OCT-4表达显著增高,具有更强的干细胞特性。2、缺氧促使A549干细胞球增殖能力增强,并维持胞内低ROS浓度,抑制细胞凋亡刺激。3、沉默HIF-2α能够促进A549干细胞球的细胞凋亡。