唾液腺是动物体内重要的分泌腺体。果蝇等昆虫的唾液腺通常由对称分布的两个腺体组成,每个腺体包含腺腔、包围腺腔的柱状分泌细胞以及与腺腔相连的导管组成。目前,已报道的果蝇等昆虫唾液腺的功能是合成相关蛋白并通过外分泌（exocrine）方式分泌至唾液腺腔,并通过导管排入口器,参与食物润滑、消化、免疫、蛹体黏附以及昆虫与宿主植物互作等多种生物学过程。有趣的是,哺乳动物唾液腺中的研究还认为,唾液腺除了能以这种外分泌方式发挥作用外,还可能通过内分泌（endocrine）方式发挥作用。比如,牛唾液腺产生的腮腺素可能分泌到血液中,再通过血液循环作用于靶器官,从而促进细胞生长。尽管如此,但动物唾液腺的内分泌作用尚未得到严格证实。动物系统性生长是指各组织器官通过合适的生长速度来适应个体生长的过程,最终使各组织器官相较于个体有适宜的比例和大小。该过程主要由两种经典的营养感知信号通路来调控,即胰岛素/胰岛素类似肽信号（IIS）和雷帕霉素靶蛋白（m TOR）信号。果蝇系统性生长的主要调节因子胰岛素类似肽2（Dilp2）由位于脑中产胰岛素细胞（IPCs）合成并分泌,遗传删除IPCs会导致系统性生长受阻,而Dilp2过表达则促进系统性生长。此外,营养感知器官脂肪体中的m TOR信号可以与IIS信号耦合来调节果蝇生长。尽管果蝇唾液腺器官的生长与个体的生长是协同进行的,但唾液腺在个体系统性生长过程中的功能尚不清楚。本研究以果蝇为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学、蛋白质组学等多种分析策略,从个体、组织、细胞水平探究了唾液腺在果蝇幼虫生长发育过程中的作用,发现唾液腺特异的内分泌因子Sgsf通过增强脑IPCs中Dilp2的分泌来促进果蝇系统性生长。主要研究结果如下:1.果蝇唾液腺删除阻碍个体系统性生长为了解析唾液腺在果蝇幼虫生长发育过程中的作用,我们利用果蝇唾液腺特异性的Sg-Gal4驱动促凋亡基因Grim或Rpr在唾液腺细胞中过表达,直接将唾液腺进行遗传删除,进而观察唾液腺删除后对个体生长发育的影响。结果显示,唾液腺删除导致蛹体变小。在果蝇产卵后120 h,对幼虫翅原基、脂肪体和脑解剖观察发现,唾液腺删除后,幼虫翅原基、脂肪体和脑均出现变小表型。此外,唾液腺删除还导致果蝇成虫个体、体重和翅面积均变小。以上结果表明,唾液腺参与调控果蝇的系统性生长。我们进一步探究了唾液腺删除引起的系统性生长受阻表型是否是因为影响了幼虫的取食与消化过程所致。基于溴酚蓝盐染料标记的培养基食物喂食实验表明,唾液腺删除的幼虫可以正常取食和消化食物。此外,考虑到唾液腺删除后的培养基食物出现了变干、变硬现象,进而探究了这种培养基状态是否会影响果蝇的系统性生长,即将标准的培养基食物用带有绿色荧光蛋白标记的正常果蝇进行预处理,以保持培养基湿润、柔软状态,然后将唾液腺删除的幼虫放入上述条件培养基中培养。结果显示,尽管在湿润、柔软的培养基食物中喂养,唾液腺删除的果蝇幼虫仍然发育成更小的蛹。最后,通过对部分参与唾液腺外分泌作用的分泌因子进行RNA干扰（RNA interference,RNAi）实验发现,果蝇蛹体大小没有明显变化。以上结果表明,唾液腺删除并不影响幼虫取食与消化过程,而且唾液腺删除导致的食物干硬状态以及部分外分泌因子的RNAi也不影响系统性生长。2.果蝇唾液腺特异的Sgsf蛋白分泌进入血淋巴大量研究表明,果蝇脂肪体、翅原基等非神经元组织可以通过内分泌方式向血淋巴中分泌一些因子来调控个体的系统性生长。由于唾液腺删除同样导致果蝇系统性生长受阻,因此我们猜测唾液腺也可能通过内分泌方式分泌一些因子来发挥作用。为此,我们采用LC-MS/MS蛋白质组学技术,对血淋巴中来源于唾液腺的潜在分泌蛋白进行了筛选鉴定。我们在对照组血淋巴中鉴定到544个蛋白,Sg＞Grim组血淋巴中鉴定到294个蛋白,Sg＞Rpr组血淋巴中鉴定到191个蛋白。通过系列分析发现,唾液腺删除导致编号为CG44956的未知功能蛋白在血淋巴中缺失,该蛋白含有信号肽,且在幼虫唾液腺中特异表达;我们将其命名为唾液腺分泌的因子（salivary gland-derived secreted factor,Sgsf）。进一步的Western杂交结果显示,果蝇唾液腺组织和血淋巴中的Sgsf蛋白水平呈动态变化,在幼虫末龄初期（产卵后84 h）,唾液腺中的Sgsf蛋白水平较低,血淋巴中水平较高;在幼虫末龄后期（产卵后120 h）,这种趋势则相反,即唾液腺中的Sgsf蛋白水平较高,血淋巴中水平较低。免疫荧光结果显示,Sgsf定位在唾液腺外层基膜,并不定位在唾液腺腔。特别重要的是,在过表达含信号肽序列的完整Sgsf基因的果蝇唾液腺和血淋巴中均可以检测到Sgsf蛋白;但去除信号肽后,则只能在唾液腺中检测到去除信号肽的Sgsf,而血淋巴中则检测不到。此外,细胞水平的实验证实,在果蝇S2细胞中过表达完整序列的Sgsf,能在细胞培养基中检测到Sgsf蛋白,但去除信号肽后则检测不到。综合以上结果表明,果蝇唾液腺特异表达的Sgsf蛋白可由唾液腺通过内分泌方式分泌进入血淋巴。3.果蝇Sgsf蛋白促进个体系统性生长为了探究唾液腺特异表达且分泌进入血淋巴的Sgsf蛋白的生理功能,我们首先利用CRISPR/Cas9方法对Sgsf基因进行敲除。对纯合敲除个体的基因组测序发现,sg RNA位点附近出现碱基缺失并造成Sgsf移码突变;Western杂交结果显示,Sgsf敲除果蝇的唾液腺和血淋巴中均检测不到Sgsf蛋白;表型方面,Sgsf敲除导致蛹体、幼虫各组织器官以及成虫个体、体重和翅面积均变小,这与唾液腺删除引起的系统性生长受阻表型相似。此外,我们还构建了两个靶向Sgsf序列不同位点的RNAi品系,在唾液腺中对Sgsf基因进行组织特异性RNAi,同样使蛹体变小。最后,在唾液腺中过表达Sgsf可以使蛹体和幼虫各组织器官增大,而Sgsf敲除引起的蛹体变小表型能够被唾液腺特异性过表达Sgsf所挽救。综合分析以上结果表明,唾液腺特异表达且分泌进入血淋巴的Sgsf蛋白可促进果蝇系统生长。4.果蝇Sgsf蛋白通过增强脑IPCs中Dilp2的分泌来促进系统性生长鉴于果蝇系统性生长主要受到IIS/m TOR信号通路的调控,我们进而探究了Sgsf蛋白是否通过该信号来调控果蝇的系统性生长。结果显示,与对照相比,在Sgsf敲除果蝇的脂肪体中,IIS/m TOR信号通路Akt、S6K和4E-BP等关键效应分子的磷酸化修饰水平均降低。同样,唾液腺删除也降低了脂肪体中Akt、S6K和4EBP的磷酸化修饰水平。此外,利用脂肪体特异性的Cg-Gal4对IIS/m TOR信号通路的胰岛素受体基因In R、m TOR及S6K基因分别进行过表达,结果都能够挽救Sgsf敲除导致的果蝇蛹体变小表型。最后,用高蛋白培养基食物喂养唾液腺删除的幼虫也可以挽救唾液腺删除导致的蛹体变小表型,以上结果说明,果蝇唾液腺分泌的Sgsf蛋白通过影响IIS/m TOR信号通路来调控系统性生长。果蝇脑IPCs分泌进入血淋巴的胰岛素类似肽Dilp2是IIS/m TOR信号通路的关键配体,在调节系统性生长过程中起关键作用。因此,我们重点检测了Sgsf蛋白对Dilp2分泌的影响。结果显示,Sgsf的敲除导致脑IPCs中Dilp2出现积累,而血淋巴中Dilp2水平降低;唾液腺删除或Sgsf的唾液腺特异性RNAi同样导致Dilp2在脑IPCs中积累;唾液腺特异性过表达Sgsf则促进Dilp2的分泌。进一步在Sgsf敲除的基础上,利用IPCs特异性的Dilp3-Gal4驱动钠离子通道蛋白基因Na Ch Bac在IPCs中特异过表达,则可以挽救Sgsf敲除导致的Dilp2积累和蛹体减小的表型。此外,通过果蝇幼虫脑的离体培养及相关处理实验,证实Sgsf蛋白可直接作用脑来促进Dilp2分泌。综合分析以上结果表明,果蝇唾液腺分泌进入血淋巴的Sgsf蛋白促进脑IPCs中Dilp2的分泌,进而调控脂肪体中的IIS/m TOR信号并影响个体的系统性生长。5.蜕皮激素对果蝇Sgsf表达及分泌的影响蜕皮激素是参与调控果蝇变态发育的关键内分泌激素之一,在幼虫末龄初期血淋巴中出现的较低水平的蜕皮激素滴度峰促进幼虫进入最终生长阶段,而在幼虫末龄后期血淋巴中出现的较高水平的蜕皮激素滴度峰抑制幼虫取食并停止生长。上述的研究发现,果蝇Sgsf的转录及分泌水平在幼虫末龄初期较高,而在幼虫末龄后期水平较低,这种动态变化可能与蜕皮激素滴度的周期性变化有关。鉴于此,我们分析了蜕皮激素对果蝇Sgsf表达及分泌的潜在调控作用。在果蝇幼虫末龄初期的唾液腺中对蜕皮激素受体基因Ec R进行特异性RNAi,结果导致Sgsf的转录水平下调,表明幼虫末龄初期较低水平的蜕皮激素促进Sgsf的转录。此外,在果蝇幼虫末龄后期对唾液腺中的Ec R基因进行RNAi,结果使血淋巴中Sgsf蛋白水平升高,暗示幼虫末龄后期较高水平的蜕皮激素抑制了Sgsf蛋白的分泌。