基于没食子酸辛酯与蓝光对荧光假单胞菌及其生物被膜光动力灭活机制的研究

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荧光假单胞菌(P.fluorescens)是一种常见的食源性腐败菌,低温条件下能快速生长繁殖,引起水产品与肉类的腐败变质。更糟糕的是,它可以附着在食物表面并形成生物被膜,使其更难被清除,严重影响了食品品质与卫生安全。通常人们会选择利用抗生素来解决上述问题,但是抗生素的滥用会导致细菌耐药性的出现。因此,开发安全有效杀灭荧光假单胞菌并根除其生物被膜的方法迫在眉睫。研究表明,天然植物提取物,例如酚酸类化合物,具有抗氧化、抑菌与抗炎等优良的生物活性。而相较于酚酸类物质,酚酸酯类物质则具有更强的生物活性。已有研究证明,没食子酸烷基酯(GACs)相较于没食子酸在抑菌、抗生物被膜、抗氧化及抗炎等功效上展现出了更优异的活性。GACs中不同长度的烷基链对其生物活性的影响差异显著,尤其是抑菌活性。其中,分子结构中含有8个碳的烷基支链的没食子酸辛酯(OG)展现出了与细菌膜最佳的亲和力和最优的抑菌活性。同时,OG还被美国食品药品监督管理局(FDA)与世界卫生组织(WHO)所允许作为一种功能性添加剂添加到食品当中。基于此,本研究开发了一种将OG与蓝光(420 nm)辐照结合的超高效光动力失活系统,并首次发现了OG具有抑菌性与光敏性的双重功效。将OG介导的光动力失活技术(PDI)运用于高效杀菌与生物被膜的清除中,并深入阐明了OG介导的PDI抑菌机制,最后将PDI技术与纳米静电纺丝技术相结合,将包含有OG的光敏性纳米材料应用于中国大鲵肉块的贮藏保鲜中,展现了其作为光动力抑菌材料在食品安全领域的广阔应用。本论文主要研究结果如下:1.通过对没食子酸(GA)与没食子酸烷基酯(GACs)的抑菌活性进行了初步筛选,分别选用了荧光假单胞菌(G+)与金黄色葡萄球菌(G-)作为实验菌种,测定了GA与GACs对它们的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)。并结合油脂分配系数分析了GACs的疏水性对上述目标菌的抑制活性的影响。结果显示,OG对两种实验菌皆具有优良的抑菌活性,MIC值与MBC值分别为0.1m M、3.2 m M与0.05 m M、0.1 m M。随后,通过分析细菌对GA与GACs的亲和力,比较了细菌对具有不同烷基链长的GACs的摄取水平与摄取速率,其中OG对荧光假单胞菌与金黄色葡萄球菌都具有最快的摄取速率(90.6 min-1与124.5min-1),这表明了细菌与OG的亲和力最佳,进一步证实了细菌对GACs的亲和力与GACs的抑菌活性关系紧密。最后,通过将OG与蓝光辐照有效结合,实现了OG在低浓度(0.4 m M与0.1 m M)下对荧光假单胞菌与金黄色葡萄球菌的快速杀灭(15 min与10 min)。2.研究了OG与蓝光协同介导的PDI对荧光假单胞菌高效抑菌的抑菌机理。OG由于其疏水部分与细菌细胞膜具有高度亲和性,可以与细菌细胞膜相互作用,发挥其优良的抗菌能力。通过测定蓝光辐照下荧光假单胞菌对OG的摄取情况,发现蓝光辐照有利于促使OG更快更多地渗透入细胞内,胞内积累大量的OG在蓝光辐照时会发生光催化氧化还原反应,发生电子转移产生双氧水(H2O2),H2O2随后被蓝光光解产生羟基自由基(●OH)。因此,产生的●OH会进攻细菌细胞中多个靶点,例如细胞膜、脂质与蛋白质,使得细菌难以产生耐药性。因此,由于OG与蓝光协同作用所产生的ROS具有多靶点的进攻方式,该技术可以被认为是一种低风险、安全高效的杀菌手段。3.研究了OG与蓝光协同介导的PDI对荧光假单胞菌生物被膜的影响。首先研究了OG协同蓝光辐照抑制生物被膜形成的能力,在保证细菌活性的亚致死前处理条件下(0.1 m M+15 min BL),生物被膜的形成量降低了84%,有效地抑制了生物被膜的形成。接着又研究了OG协同蓝光辐照对于成熟生物被膜的清除作用,结果显示,在0.4 m M OG协同蓝光辐照作用90 min后,55%的成熟生物被膜被有效清除。因此,OG介导的PDI还可以有效清除成熟生物被膜,减少其生物量。最后,通过分析生物被膜与上清液中活菌数,发现OG介导的PDI在减少生物被膜生物量的同时,还降低了其中的活菌数,分别使得生物被膜与上清液中活菌数下降了68%与79%。以上结果证明了OG介导的PDI不仅对浮游细菌有高效杀灭作用,还可以抑制生物被膜的形成并有效清除成熟生物被膜。4.研究了没食子酸辛酯/β-环糊精纳米纤维(OG/βCD-IC NFs)作为新型光动力抑菌纳米材料对于中国大鲵肉块的贮藏保鲜作用。OG/βCD-IC NFs作为一种光动力抑菌纳米材料,在溶液环境中可以通过释放OG实现光动力灭菌。与此同时,将OG/βCD-IC NFs包覆于中国大鲵肉块表面,可以有效抑制大鲵表面微生物的生长(前9天无任何微生物检出),并在一定程度上维持了大鲵肉新鲜的风味,延长了货架期。展现了其作为新型光动力抑菌材料在食品安全领域的广阔应用前景。
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