人未成熟卵母细胞miRNAs的筛选及miR-133b功能的初步研究

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目的:采用microRNA基因芯片技术,筛选人GV期和MI期卵母细胞差异表达的miRNAs,发现与人卵母细胞发育相关的miRNAs。选取特异性高表达的miR-133b作为研究靶标,预测miR-133b的潜在靶基因,并初步阐明miR-133b与TAGLN2之间的调控作用,为进一步研究其调控卵泡发育的分子机制奠定基础。  方法:收集人GV期和MI期卵母细胞,用/不用含有胰岛素样生长因子-1(IGF-1)培养液培养24h后,采用microRNA微阵列技术筛选差异性表达的miRNAs;采用靶基因预测软件DIANA、TargetScan4.0和PicTar预测miR-133b的潜在靶基因;Realtime-PCR技术检测用/不用含有IGF-1培养液培养的MI期卵母细胞中TAGLN2的表达情况;用miR-133b分别与构建成功的TAGLN2-3′UTR及其突变表达载体共转染HEK293T,双荧光素酶报告系统探讨miR-133b与TAGLN2 mRNA靶向结合活性;将miR-133b转染至293T细胞后,采用免疫印迹和realtime-PCR实验技术分析miR-133b对TAGLN2表达的影响。  结果:用含有IGF-1培养液培养的GV期卵母细胞中有183个miRNAs表达上调,117个miRNAs表达下调。用含有IGF-1培养液培养的MI期卵母细胞中有145个miRNAs表达上调,200个miRNAs表达下调;miR-133b在含有IGF-1培养液培养的MI期卵母细胞上调32倍,而在用/不用含有IGF-1培养液培养的GV期卵母细胞中表达无差异;通过靶基因预测软件发现miR-133b可能存在68个潜在的靶基因,其中TAGLN2是其潜在靶基因之一。经含有IG F-1培养液培养的MI期卵母细胞,TAGLN2的表达明显降低。miR-133b与psiCHECK-TAGLN2-3′UTR-m共转染HEK293T细胞后,双荧光素酶报告基因活性没有明显变化。miR-133b与空载体psiCHECK共转染HEK293T细胞后,双荧光素酶报告基因活性也没有明显变化。miR-133b与psiCHECK-TAGLN2-3′UTR共转染HEK293T细胞后,双荧光素酶报告基因活性显著降低。miR-133b的结合位点在TAGLN2-3′UTR第215-250位核苷酸序列。在293T细胞中过表达的miR-133b使TAGLN2蛋白质和mRNA表达下调,而当miR-133b被抑制后,TAGLN2表达上调。  结论:本研究筛选出人GV期和MI期卵母细胞差异表达的miRNAs,发现miR NAs参与调节人卵泡发育。相对未处理的MI期卵母细胞,含有IGF-1培养液培养的MI期卵母细胞中miR-133b表达上调,TAGLN2表达下调。miR-133b是MI期卵母细胞特异性高表达的miRNA,其靶基因之一是TAGLN2。miR-133b直接靶向作用于TAGLN2-3′UTR,抑制TAGLN2 mRNA和蛋白质的表达。miR-133b可能调控TAGLN2的表达,从而影响卵泡发育和成熟过程。
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