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γ-丁酸内酯(GBLs)在链霉菌抗生素生物合成和形态分化中扮演着重要的角色。它是以群体感应信号的方式,通过与其受体蛋白结合成一个信号分子系统来发挥功能。本论文对委内瑞拉链霉菌JadR3和其配体(SVB1)在杰多霉素生物合成中的调控机制进行了研究。 jadR3位于γ-丁酸内酯生物合成基因—jadW123的上游。jadR3破坏导致杰多霉素产量大幅度降低。转录分析表明,JadR3对jadW1,jadR2以及自身基因的转录行使抑制作用,而对杰多霉素生物合成的关键激活子基因jadR1行使激活作用。EMSA和DNase I footprinting实验表明,JadR3在jadR2-jadR1基因间区有三个结合位点(AREⅠ,AREⅡ,AREⅢ),在jadW1-jadR3基因间区有一个结合位点(AREⅣ)。AREⅡ位点保守碱基的突变导致JadR3不能与此位点结合,同时导致杰多霉素的产量以及jadR1的转录水平降低,说明JadR3主要是通过AREⅡ位点来激活jadR1转录的。 为研究γ-丁酸内酯生物合成基因(jadW1、jadW2和jadW3)在杰多霉素生物合成的功能,本文构建了系列突变株并进行了杰多霉素产量的分析。结果表明,jadW123三基因同时敲除或jadW2基因单独敲除都使杰多霉素不能产生,jadW3基因敲除则使杰多霉素的产量降低。与之相比,γ-丁酸内酯合成关键酶编码基因jadW1的破坏对杰多霉素产量则没有影响,研究表明JadW1功能可以被SVEN_5903所替代。jadW123破坏株抽提物丧失了将JadR3从其结合的ARE位点上解离下来的的能力,暗示JadW123负责合成了JadR3的配体。 为深入研究配体的功能,我们制备了600 L的委内瑞拉链霉菌ISP5230发酵液,经分离和纯化,得到了1.8 mg JadR3配体,命名为SVB1。利用质谱和核磁共振分析,鉴定了SVB1结构为γ-丁酸内酯类化合物,其结构与天蓝色链霉菌中信号分子SCB3基本相同。添加1nM的SVB1能诱导jadW12破坏株产生杰多霉素,说明SVB1作为信号分子是杰多霉素产生所必需的,并且表现出“微生物激素”的特征。天蓝色链霉菌野生型M145和委内瑞拉链霉菌jadW123破坏株共培养时也能恢复杰多霉素的产生,而添加SVB1至天蓝色链霉菌中能诱导Act和Red的产生,说明SVB1/SCB3可以作为种间信号诱导天蓝色链霉菌和委内瑞拉链霉菌中抗生素的生物合成。 在委内瑞拉链霉菌基因组中发现一对与jadW1/jadR3类似的基因(sven_4183/4182)也组成了信号分子系统。我们开展了两套信号分子系统对氯霉素生物合成影响的研究。SVB1缺失导致氯霉素产量降低,而jadR3破坏则导致氯霉素产量提高;sven_4183破坏对氯霉素产量没有影响,而sven_4182的破坏则导致氯霉素产量降低。转录结果表明SVB1正调控sven_4183/4182的表达,表明SVB1可以通过多种途径控制氯霉素的生物合成。