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香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上重要的病害之一,在世界上许多香蕉种植区都有发生,也是我国各香蕉种植区最严重的香蕉病害之一,其中4号生理小种引起的香蕉枯萎病在我国海南、广东、福建有发生。目前,利用抗病品种是控制该病最经济、最有效的措施,但是,抗病品种推广几年后就丧失抗病性,给抗病品种的选育和推广带来了很大的困难。因此研究香蕉枯萎病菌的群体遗传多态性,揭示其变异规律和动态,可为选育持久抗病品种和抗病品种的合理布局提供理论依据。同时,建立香蕉枯萎病菌PEG介导转化系统,对于香蕉枯萎病菌基因的克隆、研究基因的表达调控机理、基因功能具有重要意义;将绿色荧光蛋白基因转化入香蕉枯萎病菌,为进一步运用绿色荧光蛋白标记研究香蕉枯萎病菌的侵染过程奠定基础。本研究为香蕉枯萎病的防治提供理论基础,对我国香蕉枯萎病菌的遗传多态性进行了分析,同时,建立了香蕉枯萎病菌PEG介导转化系统,且将绿色荧光蛋白基因转化入香蕉枯萎病菌。本研究在中国首次报道4号生理小种菌株Foc-37的生物学特性,同时比较研究了Foc-37与1号生理小种菌株Foc-2的生物学特性。两菌株在20℃-30℃范围内均生长良好,最适温度均为25℃;两菌株在pH值3-11均能生长,最适pH值都为8,但两菌株对酸碱的反应存在差异,Foc-37菌株较Foc-2菌株较耐酸性环境,而在碱性较强的条件下(pH10-11),Foc-2菌株明显较Foc-37菌株生长良好;两菌株在9种不同的碳源培养基和对照中均能生长,在以山梨糖为碳源的培养基上生长最差,以葡萄糖为碳源的培养基最适于Foc-37菌株生长,而麦芽糖为碳源的培养基最适于Foc-2菌株生长;两菌株分生孢子在12℃-40℃范围内均可萌发,适宜的孢子萌发温度为20℃-36℃,最适萌发温度为28℃,两菌株分生孢子萌发对温度的反应存在明显差异,Foc-37的分生孢子萌发率曲线呈双峰型,温度为24℃时孢子的萌发率明显降低,相同温度下,Foc-37的孢子萌发率高于Foc-2的孢子萌发率;两菌株分生孢子可以在pH值2-8的范围内萌发,最适萌发的pH值为5,当pH值为9-12时,孢子停止萌发,在相同pH值条件下,菌株Foc-37分生孢子萌发率大于Foc-2的分生孢子萌发率。本研究首次报道在中国海南存在香蕉枯萎病菌4号生理小种,为政府部门采取强有效的措施提供了理论依据。本研究发现来自于广东的Foc-20菌株为强致病性的菌株,在选育抗4号生理小种品系时,可以采用Foc-20菌株来接种。本研究发现引物OPM-15在进行PCR时,在所测试的12个1号生理小种菌株中,能扩增出约1000 bp,500 bp的条带,而相应地在相同位置上在所测试的6个4号生理小种菌株中,没有扩增出条带;在所测试的6个4号生理小种菌株中,扩增出约500 bp的条带,而相应地在相同位置上在所测试的12个1号生理小种菌株中,没有扩增出条带。通过比较RAPD分析结果与菌株所属的生理小种、菌株的地理来源、菌株的致病性之间的关系,我们发现,RAPD分析能区分1号、4号生理小种菌株的地理来源;RAPD分析大致能区分1号生理小种和4号生理小种菌株;RAPD分析能区分4号生理小种菌株致病性的强弱。本研究应用RAPD分析技术,监测香蕉枯萎病菌的菌系分化和动态分布,对充分利用和挖掘现有品种的抗病性,合理布局和轮换品种,制定有效的综合防治措施具有重要的意义。本研究首次对海南14个枯萎菌株进行了营养亲和性测定。14个枯萎菌株的252个菌落中共得到了104个抗氯酸盐突变体,频率为41.3 %,本研究中鉴定出3种突变类型共67个nit突变株,这3种突变型的频率分别为nit l 86.57 %、nit M 8.95 %、nit 3/nit 8 4.48 %。每个分离物产生Nit突变体的表型种类具有较大的差异,nit l表型出现的频率最高,即硝酸还原酶的结构位点最容易发生突变,其次是nit M表型,nit 3/nit 8表型出现的频率最低。供试的14个香蕉枯萎病菌菌株被分为2个营养亲和群,VCG 1和VCG 2,VCG 1中的所有菌株皆为分离自粉蕉的1号生理小种,VCG 2中的所有菌株则全为分离自香蕉的4号生理小种,表明海南省的香蕉枯萎病菌营养体亲和群与病原菌的寄主来源、生理小种有一定关系。本研究建立了香蕉枯萎病菌PEG介导转化系统。将分生孢子接种到马铃薯葡萄糖液体培养基上,在28℃下振荡(180r/min)培养24 h,培养液经4层纱布过滤获得菌丝,用0.8 mo1/L NaCl充分洗涤,然后在50 mL灭菌三角瓶中加入5 mL 10mg/mL酶液,250 mg湿菌丝,30℃下恒温振荡(80r/min)培养3.5 h后,用3层擦镜纸过滤除去菌丝碎片,取收集的滤液置于灭菌过的15 mL尖底离心管中(下同),离心(4000 r/min,4℃,10min,下同)收集沉淀,再轻轻地将沉淀悬浮于3mL 1 mol/L MgSO4溶液中。离心后取上清,慢速加入等体积灭菌蒸馏水,使MgSO4的浓度为0.5mol/L,离心,弃上清液,沉淀用山梨醇溶液(STC) (1.2 mol/L sorbito1;10 m mol/L Tris-HCl (pH7.5);10 m mo1/L CaCl2)洗涤原生质体两次,离心沉淀原生质体,用STC稀释,在光学显微镜下计数,使原生质体数的终浓度为2×107-3×107个/mL。取1mL原生质体,加人10μg质粒DNA,25μL 2×STC(2mol/L sorbito1;100 m mol/L Tris-HCl (pH 8.0);100mmo1/L CaCl2),25μL 60% PEG4000,混合后室温放置20min。加人1.2 mL 60% PEG4000溶液,混匀后室温放置5min。再加人4mL山梨醇溶液,3000r/ min离心l0min,沉淀用2mL山梨醇溶液悬浮,取0.2mL涂布于含0.8 mo1/L蔗糖的PDA再生培养基上,28℃培养12h后,覆盖l0mL含150μg/mL HmB的1%水琼脂,28℃继续培养6-7天后观察结果。长出的菌落为转化子。应用本研究建立的香蕉枯萎病菌PEG介导转化系统,将绿色荧光蛋白基因成功地转化入香蕉枯萎病菌,为运用发绿色荧光的香蕉枯萎病菌研究病菌的侵染过程奠定了基础。转化子继代培养9次后,仍能发出稳定而均一的绿色荧光,其致病力与野生型菌株的相同,菌落形态与菌丝生长速度不改变,绿色荧光蛋白基因已经整合入病菌基因组。