喹噁啉类化合物具有多种生物功能,被广泛运用于畜禽业,主要包括卡巴氧、喹乙醇(OLA)、乙酰甲喹、喹烯酮和喹赛多(CYA)。喹噁啉类药物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效,尤其是在厌氧条件下抗菌效果特别好。尽管喹噁啉类药物具有比较好的抗菌作用,但是它们的抗菌作用机制并不是很清楚。之前的研究表明,喹噁啉类药物是通过损伤DNA来发挥抗菌作用的,但是,喹噁啉类药物是怎样损伤DNA的并不清楚,而且研究对象几乎都是大肠杆菌。为了更好的阐明喹噁啉类药物的抗菌作用机理,本次实验选取对喹噁啉类药物都比较敏感的两株厌氧菌作为实验菌种:一株是革兰氏阳性菌产气荚膜梭菌,一株是革兰氏阴性菌猪痢疾短螺旋体,并选取喹赛多和喹乙醇作为喹噁啉类药物的代表药物进行研究。在厌氧条件下,通过高效液相色谱仪(HPLC)分析喹赛多和喹乙醇在两种细菌中的脱氧代谢物的种类并检测脱氧代谢物的抗菌活性;研究喹赛多和喹乙醇对起两株细菌的形态影响,对细菌的细胞膜、细胞壁的和染色体DNA的完整性的影响;通过荧光探针探针检测经过喹噁啉类药物作用后细菌体内的活性氧自由基。本实验的研究能够更好的阐述喹噁啉类药物在厌氧条件下的抗菌作用机理,是对喹噁啉类药物抗菌作用机制的验证和补充,有助于喹噁啉类新药物的研发,并为喹噁啉类新药物的临床应用提供更加可靠的科学依据。1喹噁啉类药物在两株菌体内的脱氧代谢物种类及其代谢物的抗菌活性在厌氧条件下,药敏试验结果表明喹赛多对产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体的MIC值分别为1、0.031μg/mL,喹乙醇对产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体的MIC值分别为1、0.0625 μg/mL,这说明喹赛多和喹乙醇对产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体都很敏感。通过HPLC分别在产气荚膜梭菌CVCC1125和猪痢疾短螺旋体B204与喹赛多孵育的上清液中检测到喹赛多的两种脱氧代谢物(Cyl,脱二氧喹赛多;Cy2,N4脱一氧喹赛多),但是均没有检测到N1脱一氧喹赛多(Cy2)。用同样的方法分别在产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体与喹乙醇孵育的培养基上清液中检测到喹乙醇的两种脱氧代谢物(01,N1脱一氧喹乙醇;02,脱二氧喹乙醇),但是没有检测到N4脱一氧喹乙醇(07)。药敏试验结果表明喹赛多和喹乙醇的脱氧代谢物对产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体均没有抗菌活性,这说明喹噁啉类药物确实是在脱氧过程中发挥抗菌作用。2.喹噁啉类药物对产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体的形态变化的影响在本实验中,通过光学显微镜发现亚抑菌浓度(1/2 MIC)喹赛多和喹乙醇处理组的产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体的菌体都较空白组的菌体变长,呈纤维丝状,这种现象可能是细菌DNA受损后的出现的应激反应。扫描电镜(SEM)图表明:喹噁啉类药物作用于产气荚膜梭菌后,细菌变长,表面还变得粗糙,甚至出现了断裂;猪痢疾短螺旋体经喹噁啉类药物处理后,菌体出现聚集,卷曲现象,有些菌体甚至出现畸形。透射电镜(TEM)图表明:喹噁啉类药物作用于产气荚膜梭菌后,菌体出现了不均等分裂现象,细胞质变得稀疏。猪痢疾短螺旋体经喹噁啉类药物处理后,细胞质泄露很严重。3.喹噁啉类药物对两株菌的细胞壁和细胞膜的完整性影响在本研究中,经过喹噁啉类药物处理的产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体的培养液上清中的碱性磷酸酶的水平与空白组相比较有所增加,而且产气荚膜梭菌上清液中的碱性磷酸酶水平比猪痢疾短螺旋体的上清液中碱性磷酸酶水平更高,这是可能是因为产气荚膜梭菌在遇到氧化应激后会产生孢子,在这个过程中,碱性磷酸酶的合成量会有所增加。通过测定细胞内的泄漏物质在260 nm的吸光度来反映细胞膜的完整性是否遭到破坏。OD260的升高象征着细胞质中核酸的泄露,因此能够反映细胞膜是否收到损伤。结果表明,经过药物处理后,细菌上清液在260 nm处的吸光度随时间在增加,而且药物浓度越高,OD260的升高依赖于药物的浓度和孵育的时间。4.产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体内的自由基在厌氧条件下,MIC和4 MIC的喹赛多作用于产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体后体内有活性氧自由基(ROS)产生。药物浓度越高,ROS水平越高。然而不同浓度的喹噁啉作用于产气荚膜梭菌后,ROS水平在90～120 min有所下降,与此相反,猪痢疾短螺旋体体内的ROS水平在30 min～120 min内处于累计状态,这可能是由于产气荚膜梭菌体内的超氧化物气化酶(SOD)和过氧化氢酶的清除活力更强引起的。根据以前的报道,喹噁啉类药物在体内是通过酶的作用下产生自由基中间体从而对DNA造成损伤。厌氧条件下,这种自由基中间体可能通过化学反应产生羟基自由基。在本实验中,MIC和4 MIC的喹赛多作用于产气荚膜梭菌后菌体内都有羟基自由基产生,羟基自由基会损伤细胞膜,DNA以及内部的呼吸系统,最终引起细胞壁损伤。5.喹噁啉类药物诱导的两株菌的染色体DNA损伤8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)水平是DNA遭到氧化性损伤程度的标志物,本实验中,喹噁啉类药物作用后的产气荚膜梭菌和猪痢疾短螺旋体内的8-OHdG水平跟空白组相比较,明显升高,说明药物作用后这两株菌体内的染色体DNA受到了氧化性损伤。而8-OHdG的形成又会导致DNA的断裂,染色体DNA断裂可以通过琼脂糖凝胶显示。琼脂糖凝胶电泳图显示经过药物处理后的两株菌的DNA均有拖尾和弥散现象,这说明染色体DNA出现了降解和断裂。除此之外,猪痢疾短螺旋体的基因组中发现了片段大小为6～8kb的条带,根据文献报道,这可能是猪痢疾短螺旋体内被诱导的前噬菌体VSH-1。总之,在厌氧条件下,喹噁啉类药物是具有厌氧选择活性的还原性DNA损伤剂,通过药物代谢过程中产生的ROS和羟基自由基不仅仅可以造成DNA的氧化性损伤而且还会造成细胞壁和细胞膜的损伤,从而最终导致细菌死亡。本实验验证了喹噁啉类药物在无氧环境更有利于喹噁啉类药物代谢过程中自由基的有效产生,而且喹噁啉药物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗拒能作用机制是相似的。