研究目的利用异种(猪皮、牛心包)来源的ATM组织工程补片,在实验动物中国小型实验猪体内建立阴道重建及阴道粘膜下生物补片埋植的动物模型,针对重建后人工阴道进行组织病理学评价,针对阴道埋植模型进行补片功能学、组织相容性及降解率评估。以期判定异种ATM补片是否为人工阴道重建及盆底修复手术的理想材料,从而为人工阴道成型术及盆底修复手术开辟新的道路。材料及方法1、动物实验：1)选取中国小型实验猪为实验动物,建立其阴道缺损及利用异种(B型牛心包来源和P型猪皮来源)来源的ATM补片重建新阴道模型,对小型猪围手术期、术后恢复情况以及人工重建之阴道的生长情况进行观察。2)另取一组中国小型实验猪,将其阴道粘膜前后壁全层分离,并在其内埋植ATM补片(B型牛心包来源和P型猪皮来源)和人工合成补片,制成三种材料的在体模型,并对小型猪围手术期、术后恢复情况以及补片代谢情况进行观察。2、人工阴道重建模型组织学观察：1)阴道重建术后1周、2周、4周、6周、8周分别阴道全层取材,并以其中2只小型实验猪模型构建时手术中取材的正常阴道组织作为对照。2)取材后进行大体观察、HE染色、VG染色和免疫组化染色,从组织学水平动态评价新生阴道变化并运用免疫组化技术在蛋白水平对新生阴道粘膜及平滑肌进行鉴定。免疫组织化学染色标记层粘连蛋白Laminin单克隆抗体,证明新生阴道粘膜是否具有基底膜成分。3)在透射电镜下观察第1周时ATM补片的立体结构、胶原成分与周围反应的变化情况。3、在ATM补片和人工合成补片植入小型猪体内之前,在力学试验机上进行拉伸试验,考察三种材料初始断裂强度和断裂伸长率等力学特性；4、盆底修复动物模型观察：1)B型、P型ATM组分别在术后2周、4周、6周、8周、12周,人工补片对照在分别在术后2周、4周、8周各1只取材,取材范围包括全层阴道2)取材后进行大体、HE染色、ET+VG染色,动态观察补片在动物体内分解代谢、与周围基质相互转化情况,以及补片周围粘膜反应。3)在透射电镜下观察6周和8周时残存ATM补片的立体结构与周围反应的变化情况。结果1、小型猪阴道重建手术建模成功,手术切口全部如期愈合,未见感染、血肿、排斥等并发症。在预期时间段取材,未见阴道狭窄、塌陷或补片脱出等,再生阴道组织生长良好。2、P型ATM补片重建之阴道与前人利用同种异体ATM补片进行阴道重建结果基本一致,但初始上皮化的时间略晚。P型ATM补片重建阴道2周观察时才出现清晰的新生粘膜,阴道3/4已有粘膜覆盖,上段1/4仍可见少量补片残存,测量新生阴道长度5cm；镜下可见上皮层数少,在2—4层左右,平坦,极向不明确。4—6周时阴道内腔继续上皮化,外观渐接近正常阴道粘膜,补片结构肉眼不可见；镜下可见粘膜上皮层数逐渐增多,极向恢复,接近正常上皮层结构。8周时新生阴道从外观上和组织形态学检查与正常阴道已无明显差异。上皮光谱角蛋白单克隆抗体AE1/AE3免疫组织化学染色证明阴道内腔有上皮组织存在,且从重建第2周开始出现阳性,其结果与HE染色观察结果一致。VG染色及平滑肌肌动蛋白单克隆抗体α-actin的免疫组织化学染色显示,自阴道重建后第4周,基质中就开始出现散在、分布不规则的平滑肌肌细胞,此后随着时间延长,渐形成排列均匀的肌束。3、VG染色在阴道重建第1周,可见残存补片结构以胶原纤维和弹性纤维为主；2周时,在阴道重建取材的基质中,胶原纤维排列疏松,之后随着时间推移,胶原纤维排列渐致密,8周时胶原纤维排列致密。基质中层粘连蛋白单克隆抗体Laminin内免疫组化染色阳性,提示新生阴道粘膜具有基底膜成分,证明了新生阴道粘膜的完整性。B型补片因其本身的质地韧且较厚实,无法与穴道四壁贴合紧密,血供不佳,影响补片的支架作用,故上皮化效果差,认为不适宜作为阴道重建之材料。4、在将材料植入动物阴道粘膜下层之前对三种补片的力学特性进行了比较,结果显示：B型补片(牛心包来源)的平均抗拉强度为8.18MPa,平均断裂伸长率为60.93%；P型补片(猪真皮来源)平均抗拉强度为12.64MPa,平均断裂伸长率为7.66%；人工合成补片的平均抗拉强度为8.51MPa,平均断裂伸长率为98.82%。说明B型和P型补片在离体情况下,抗拉强度均与人工合成补片的水平相当。但P型补片韧性较差。5、小型猪阴道粘膜下ATM补片埋植模型建模顺利,手术切口全部如期愈合,未见感染、血肿、排斥等并发症,观察期内三种补片均无补片脱出、阴道侵蚀等现象。6、大体和组织学观察B、P两型ATM补片在动物体内都存在降解,且大致规律相同,在体内均引起异物反应,这可能是造成降解的原因。电镜下可以观察到ATM补片与宿主基质交错排列,两侧新生肉芽丰富。与ATM材料相比,人工合成补片的反应较为均一,宿主组织较好的融合进入补片网眼之间,周围可见新生胶原纤维、成纤维细胞、血管和弹力纤维。结论1、进一步完善实验动物小型猪构建阴道缺损模型制备,首次在实验动物小型猪体内建立阴道内补片埋植模型,以此模拟动物阴道粘膜周围环境,得到补片及其周围结构变化的组织学证据。模型构建稳定可靠,证明实验用小型猪是进行妇科缺损性疾病研究的理想实验动物。2、从实验动物围手术期和术后短期观察结果以及新生阴道的大体和组织形态学观察,证明利用异种P型(猪皮)来源ATM材料进行阴道重建,可以取得与同种异体(人尸皮)来源ATM类似的效果,可以作为阴道重建术的修补材料,且因其制作原料为猪皮,来源广泛,价格低廉,具有广阔的应用前景。B型(牛心包来源)补片因其物理性质较为坚韧,难以与阴道造穴贴合,不适合作为阴道重建之材料。3、从植入动物体内之前对人工合成聚丙烯网片、P型猪皮来源及B型牛心包来源ATM补片进行拉力测试的结果分析：B型(牛心包)、P(猪皮)型ATM补片的早期抗强度与人工合成补片水平相当,但P型补片韧性较差。4、在术后最长3个月的观察期内,大体和组织形态学证据表明：异种ATM补片周围存在异物反应,且呈明显降解,远期会造成补片生物力学的消减,是导致术后复发率高的原因；人工合成补片与宿主基质容受良好,无代谢痕迹。因此,作为盆底修复手术的材料,人工合成补片更有优势,而ATM补片需对其降解率进行调整才能适应修复要求。