砷化物是人类确定致癌物,亚砷酸钠(NaAsO2)是砷元素在环境中存在的主要形式。由于砷化物致癌实验动物模型一直未能成功建立,导致其致癌机制研究长期滞后。近年来砷化物所致细胞恶性转化和DNA损伤及细胞凋亡的体外模型已被应用于其致癌机制研究。目前发现不同水平砷化物致癌的分子机制可能不同,即低水平砷化物主要引起细胞过度增殖,从而引起细胞发生恶性转化而诱发癌症；而高水平砷化物可通过产生大量活性氧(ROS)引起DNA损伤和细胞凋亡,从而引起细胞突变和基因组不稳定性而诱发癌症,但其具体的分子机制目前尚不清楚。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和肿瘤干细胞(Tumor stem cells, TSCs)样特性获得参与了多种疾病,特别与恶性肿瘤的发生和发展有关。近年,虽然EMT和TSCs特性获得与肿瘤细胞恶性程度和转移关系及其分子机制的研究已成为热点,但对于EMT和TSCs特性获得在环境致癌物所致细胞恶性转化及致癌过程中的作用和分子机制的研究报道甚少。因此深入研究不同水平砷化物所致细胞恶性转化和DNA损伤及细胞凋亡的具体信号通路,特别是研究调控砷化物诱导EMT过程中TSCs特性获得在恶性转化过程中的作用及其分子机制对于寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施具有重要理论意义和实用价值。方法一、建立亚砷酸钠所致人皮肤角质(HaCaT)细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和细胞凋亡模型常规培养HaCaT细胞24h后,再分别用含0.0和1.0μM NaAsO2的RPMI1640培养液培养HaCaT细胞48～72h,如此重复培养30代(约15周)后,观察细胞增殖情况和恶性程度；用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24或48h,观察细胞增殖、DNA损伤和细胞凋亡情况。二、软琼脂集落形成实验将恶性转化和相关对照的HaCaT细胞与含0.7%低熔点琼脂糖的RPMI1640培养液等体积混合后,铺于含0.7%低熔点琼脂糖的底层培养基上,待其凝固后,表面覆以适量培养液,37;C5%CO2培养,每3-4天换液一次,4周后终止培养并计数细胞集落数。三、裸鼠皮下致瘤实验将恶性转化和相关对照的HaCaT细胞按1×107/0.2mL密度注射于Balb/c裸鼠右侧腋窝皮下,饲养4周后将肿瘤组织取出,测量肿瘤体积、固定,并作组织切片、HE染色后进行组织病理学鉴定。四、逆转录PCR (RT-PCR)提取细胞总RNA并测定其浓度,逆转录成cDNA后,分别应用mot-2、mdm2、 survivin、CD34和K5引物扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。五、Western blot提取细胞总蛋白并测定浓度,用SDS-PAGE分离蛋白、半干法转膜,用特异性一抗4℃孵育过夜,进一步常温结合二抗1h后,用增强型化学发光法检测相关蛋白表达及磷酸化水平。六、Southwestern blot提取细胞总蛋白,SDS-PAGE分离、半干法转膜后,将膜变性、复性处理,用生物素标记的κB序列DNA探针与膜杂交,通过化学发光法检测κB序列DNA与NF-κB的结合情况。七、免疫共沉淀提取细胞总蛋白,用IP抗体与蛋白混合过夜将靶蛋白沉淀后,用Western blot法检测蛋白-蛋白相互作用或用Southwestern blot检测DNA-蛋白相互作用。八、免疫荧光法检测p53的核转位水平将不同因素处理的HaCaT细胞用兔抗人p53一抗孵育24h后,用Cy3标记的山羊抗兔二抗孵育1h,用DAPI将细胞核染色15mmin后荧光显微镜下观察p53的胞内分布以检测p53的核转位水平。九、悬浮集落形成实验将1×104细胞接种至低吸附24孔板中,用含10ng/ml EGF和10ng/ml FGFβ的无血清DMEM-F12培养液培养,每2天进行一次半定量换液,如此连续培养2周后,镜下观察拍照并计数。结果一、亚砷酸钠对HaCaT细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和凋亡的影响用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h;分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞30代(约15周)。结果发现0.5、1.0和2.0μNaAsO2引起HaCaT细胞增殖升高,1.0μM NaAsO2引起增殖最明显,并出现γ-H2AX水平轻度升高；而5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT细胞增殖降低、且γ-H2AX水平和断裂caspase3水平均升高；1.0μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞能在裸鼠皮下形成肿瘤,肿瘤组织病理学切片显示为低分化上皮样癌细胞。结果显示NaAsO2在低浓度引起HaCaT细胞增殖和恶性转化：而在高浓度则引起HaCaT细胞DNA损伤和细胞凋亡。二、亚砷酸钠对HaCaT细胞p53/survivin和MAPKs及NF-κB信号通路的影响用0.0、1.0、5.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现1.0μMNaAsO2引起HaCaT细胞p-p53水平降低,而p-ERK、p-NF-κB/RelA、survivin和mot-2水平升高；5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT细胞p-JNK、p-p38和p-p53水平升高,而survivin水平降低。结果显示NaAsO2在低浓度主要激活ERK和NF-κB信号通路、抑制p53功能而引起survivin和mot-2水平升高,而高浓度则主要激活JNK和p38信号通路、激活p53功能和引起survivin水平降低。三、MAPKs和NF-κB信号通路在亚砷酸钠对p53的影响中的作用分别用0.0和10.0μM ERK抑制剂U0126、NF-κB抑制剂Bay11-7082、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580处理HaCaT细胞6h后,再分别用0.0、1.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现阻滞ERK和NF-κB均使1.0μM NaAsO2所致HaCaT细胞p-p53降低回升,且阻滞ERK使1.0μMNaAsO2所致HaCaT细胞核内p53荧光强度降低回升；阻滞JNK则使10.0μMNaAsO2所致HaCaT细胞p-p53水平和核内p53荧光强度升高回降。结果显示ERK和NF-κB信号通路主要参与低浓度NaAsO2所致细胞p53抑制过程,JNK信号通路则主要参与高浓度NaAsO2所致细胞p53激活过程。四、ERK通过NF-κB调控mot-2和survivin在低浓度亚砷酸钠所致HaCaT细胞恶性转化中的作用用20.0nM NF-KB/RelA-siRNA和con-siRNA处理HaCaT细胞12h,或用0.0和10.0μM ERK抑制剂U0126处理HaCaT细胞6h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现阻滞ERK信号通路可以阻止低浓度NaAsO2所致NF-κB与κB序列DNA结合能力；关闭NF-kB或抑制ERK均可使1.0μM NaAsO2所致HaCaT细胞mot-2和survivin的：mRNA和蛋白水平升高回降。结果显示低浓度NaAsO2所致HaCaT细胞mot-2和survivin表达上调是通过ERK/NF-κB信号通路完成的。分别用0.0和10.0μM ERK抑制剂U0126处理HaCaT细胞6h后,再用0.0和1.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24～48h,如此反复处理30代,结果发现阻滞ERK信号通路可阻止1.0μM NaAsO2慢性处理30代所致HaCaT细胞增殖升高、软琼脂上形成克隆形成和裸鼠皮下形成肿瘤。结果显示ERK在低浓度NaAsO2所致HaCaT细胞增殖、恶性转化和致瘤性中具有重要作用。五、JNK通过p53调控survivin在高浓度亚砷酸钠所致HaCaT细胞DNA损伤和凋亡中的作用分别用0.0和10.0μM JNK抑制剂SP600125处理HaCaT细胞6h后,再用0.0和10.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24h；发现阻滞JNK可抑制高浓度NaAsO2所致HaCaT细胞survivin mRNA和蛋白表达水平降低；发现高浓度NaAsO2使HaCaT细胞p53与JNK结合,而阻滞JNK后,p53主要与mdm2结合;10.0μM NaAsO2引起HaCaT细胞γ-H2AX水平和断裂caspase3水平均升高;而用10.0μM NaAsO2联合10.0μM SP600125处理HaCaT细胞γ-H2AX水平升高更多,而断裂caspase3水平升高回降。结果显示JNK通过激活p53而抑制survivin在高浓度NaAsO2所致HaCaT细胞DNA损伤和凋亡中具有重要作用。六、低浓度亚砷酸钠慢性处理诱导HaCaT细胞发生EMT和TSCs特性获得分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞30代后,结果发现1.0μMNaAsO2处理细胞20代时引起细胞形态发生间质样改变：细胞粘附能力下降,上皮细胞指标E-cadherin水平降低,而间质细胞指标N-cadherin和vimentin水平以及干细胞表面抗原CD34和K5mRNA表达升高,细胞能够形成悬浮细胞集落,且随NaAsO2处理时间延长,上述改变越明显。结果显示低浓度NaAsO2慢性处理诱导HaCaT细胞发生EMT和获得TSCs特性。七、低浓度亚砷酸钠慢性处理对HaCaT细胞NF-κB和snail的影响分别用0.0和1.0μM NaAsO2慢性处理HaCaT细胞30代后,结果发现1.0μMNaAsO2处理细胞10代时,引起HaCaT细胞经典NF-κB信号通路的p-IKKβ、 p-IκBβ和p-NF-κB/RelA水平均升高,snail水平也升高,且随NaAsO2处理时间延长,上述改变越明显。结果显示低浓度NaAsO2慢性处理HaCaT细胞可激活经典NF-κB信号通路,且上调snail水平。八、NF-κB在低浓度亚砷酸钠所致HaCaT细胞snail升高中的作用用0.0和1.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24或48h；用0.0和10.0μM NF-κB抑制剂Bay11-7082预处理HaCaT细胞6h或分别用20.0nM IKKβ-siRNA、 IKKa-siRNA或NF-κB/RelA-siRNA转染HaCaT细胞12h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2处理HaCaT细胞24h,结果发现1.0μM NaAsO2急性处理引起HaCaT细胞snail水平升高,并具有一定的时间-效应关系；阻滞经典NF-κB信号通路可抑制1.0μM NaAsO2急性处理所致HaCaT细胞snail水平升高。结果显示低浓度NaAsO2急性处理可通过经典NF-κB信号通路而引起snail水平升高。九、NF-κB在低浓度亚砷酸钠所致HaCaT细胞EMT和TSCs特性获得及致瘤性中的作用分别用0.0和10.0μM NF-κB抑制剂Bayl1-7082预处理HaCaT细胞6h后,再分别用0.0和1.0μM NaAsO2处理HaCaT细胞24～48h,如此重复处理30代。结果发现阻滞NF-κB可抑制1.0μM NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞E-cadherin水平和细胞粘附能力下降及N-cadherin、vimentin、CD34和K5水平升高,抑制细胞形态发生间质样改变,抑制细胞悬浮集落形成能力和致瘤性。结果显示NF-κB在低浓度NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞EMT和TSCs特性获得及致瘤性过程中具有重要作用。结论1. NaAsO2在低浓度引起HaCaT细胞增殖和恶性转化；而在高浓度则引起HaCaT细胞DNA损伤和细胞凋亡。2.ERK激活NF-κB而抑制p53功能和引起survivin水平降低在低浓度NaAsO2所致HaCaT细胞增殖和恶性转化过程中具有重要作用。3.JNK激活p53功能而引起survivin水平升高在高浓度NaAsO2所致HaCaT细胞DNA损伤和凋亡中具有重要作用。4.低浓度NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞恶性转化过程中发生EMT和TSCs特性获得。5.经典NF-κB信号通路激活而引起snail水平升高在低浓度NaAsO2慢性处理所致HaCaT细胞EMT和TSCs特性获得及恶性转化过程中具有重要作用。