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水稻(Oryza sativaL.)是世界主要的粮食作物之一,氮素(N)营养影响着植物从代谢到资源分配,再到生长和发育的植物功能的所有水平。常规栽培的水稻多处于淹水的环境中,硝化作用被抑制,因此其根际土壤无机氮以铵态氮(NH4+)为主。但水稻根系可以通过其发达的通气组织将地上部的氧气运输并分泌到根际,使根际的硝化细菌将部分铵态氮氧化成为硝态氮。因此,在水稻的实际生长环境中,根系一直处于铵硝混合营养中。有研究表明,水稻即使一直在淹水的土壤中生长,其吸收的总氮中有5%～40%是以硝态氮的形态吸收。植物从土壤中吸收硝态氮主要由硝态氮运输系统负责,硝态氮系统可分为高亲和运输系统(HATS)和低亲和运输系统(LATS),使植物能够应对土壤中低或高的NO3-浓度。由于水稻根部的NO3-一直处于产生被吸收再产生的循环过程中,水稻根际的NO3-一直处于较低的水平,因此水稻对NO3-的吸收主要是高亲和运输系统起作用。水稻NO3-的高亲和运输系统主要由OsNRT2家族组成。水稻NO3-运输过程中存在双组分NRT2-NAR2系统,部分OsNRT2家族成员需要与OsNAR2.1而非OsNAR2.2结合才能行使吸收和转运硝酸盐的功能。现有报道知道单独过量表达OsNRT2.1改善了水稻幼苗的生长,但不能增加NO3-吸收;OsNRT2.3a基因参与了 NO3-从根到地上部的转运;通过RNA干扰(RNAi)技术降低OsNAR2.1的表达,可以抑制突变体根中OsNRT2.1,OsNRT2.2和OsNRT2.3a的表达,从而影响了水稻对NO3-的吸收。我们通过在水稻中协同表达OsNAR2.1和OsNRT2.1,及OsNAR2.1和OsNRT2.3a,期望获得籽粒产量和氮素利用效率提高的水稻株系。为了验证OsNAR2.1的生物功能,我们通过Pull down实验获得了 OsNAR2.1新的互作蛋白OsNramp3,并用研究其功能。主要研究结果如下:1.分别用Ubi启动子和OsNAR2.1启动子启动OsNRT2.1,使OsNRT2.1在武运粳7号水稻体内过量表达。田间实验表明,与武运粳7号相比,pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因株系的生物量分别增加了约 21%和38%。pUbi:OsNRT2.1转基因株系的农学氮素利用效率(ANUE)降低到WT的83%,而pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因株系的农学氮素利用效率(ANUE)增加到WT的128%。与WT相比,pUbi:OsNRT2.1转基因株系的运往籽粒的干物质转运量减少了 68%,pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因株系增加了 46%。我们发现pUbi:OsNRT2.1转基因株系所有的部位OsNAR2.1的表达都显著提高,pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因株系OsNAR2.1的表达只在叶鞘和茎秆部提高。武运粳7号,pUbi:OsNRT2.1转基因株系和 pOsNAR2.1:OsNRT2.1 转基因株系茎 OsNRT2.1 和 OsNAR2.1 的表达比分别是7.2:1,11.3:1和4.7:1。我们发现过量表达OsNRT2.1,并使其与伴侣蛋白基因OsNAR2.1的表达比在一个比较低的水平,能提高水稻的籽粒产量和氮素利用效率。2.用OsNAR2.1特异启动子启动OsNAR2.1在武运粳7号水稻中表达。与武运粳7号相比,pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系OsNAR2.1的表达显著提高,在0.2mM,2.5 mM 15NO3-和1.25 mM 15NH415NO3的15N吸收速率提高21-32%。在这三个氮源处理下,与武运粳7号相比,pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系的生物量提高了约143%,129%和51%;总氮含量提高了约161%,242%和69%。田间实验发现,与WT相比,pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系的籽粒产量,农学氮素利用效率,干物质转运量分别增加了约21%,22%和21%。我们同时对比了,pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系和pOsNAR2.1:Os1NRT2.1转基因株系田间的生长,发现他们之间开花后的氮素吸收量差异显著,与武运粳7号相比,分别增加了约39%和85%。可能是因为pOsNAR2.1:OsNAR2.1 转基因株系后期 OsNRT2.1 的表达显著低于pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因株系导致的。这些结果表明用OsNAR2.1自身启动表达OsNAR2.1能提高水稻的NO3-吸收速率,籽粒产量和氮素利用效率。3.用组成型强启动子35S同时在武运粳7号水稻体中表达OsNAR2.1和OsNRT2.3a,获得了 OsNA2.1和OsNRT2.3a共同过量表达的转基因株系。田间实验发现,与武运粳7号相比,共超表达株系开花期的干物质积累量(DMA),成熟期的干物质积累量(DMM),扬花期的总氮含量(TNAA)和成熟时的总氮含量(TNAM)-分别增加约23.3%,18.6%,28.3%和19.5%;干物质转运效率(DMTE)和,氮素转运效率(NTE)分别提高28.9%和9.8%;最终导致籽粒产量(GY),农学氮素利用效率(ANUE)和氮素回收效率(NRE)分别增加了 22.6%,28.6%和21.2%。这些结果表明,共同过量表达OsNAR2.1和OsNRT2.3a可以提高水稻的籽粒产量和氮素利用效率。4通过pu11-down实验,酵母双杂系统和水稻原生质体双荧光互补实验(BiFC)验证,获得了 OsNAR2.1互作蛋白OsNramp3。表达模式分析,OsNAR2.1和OsNramp3在水稻灌浆期的Node I部位,苗期的叶鞘和根茎结合处具有共表达现象。OsNAR2.1和OsNramp3都受0.2 mM NO3-的诱导表达。与对应野生型相比,OsNramp3水稻敲除突变体0.2 mM 15N03-的吸收速率显著降低。OsNramp3水稻敲除突变体在0.2 mM 15NO3-的营养液中生长24小时发现,15NO3-从地下部到地上部运输受到抑制。在0.2 mMNO3-的营养液中生长3周,与对应野生型相比,OsNramp3水稻敲除突变体的生物量和总氮含量都显著降低。通过回补酵母突变体菌株发现共同表达OsNAR2.1和OsNramp3具有Fe的转运活性,并发现0.2 mM NO3-的生长条件下,水稻敲除OsNramp3影响了 Fe的吸收和分配。分析OsNAR2.1过量表达株系和OsNramp3水稻敲除突变体杂交后代表型发现,OsNAR2.1过量表达株系不能回补OsNramp3完全敲除突变体株系NG3081的生长表型,能部分回补OsNramp3部分敲除突变体NG4081的生长表型。明确了 OsNAR2.1与OsNramp3互作影响了水稻氮素利用效率。5.通过对OsNAR2.1 RNAi突变体株系和过量表达株系进行干旱敏感性实验,发现OsNAR2.1参与了水稻的干旱耐受性。与武运粳7号相比,pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系的抗旱性显著提高。在淹水条件下,与武运粳7号相比,pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系的光合速率和水分利用效率没有变化,但在控水条件下,提高了 39.2%和11.8%。与武运粳7号相比,pOsNAR2.1:Os1NAR2.1转基因株系籽粒产量在正常供水条件下增加28.2%,在控水条件下增加70.7%。pOsNAR2.1:OsNAR2.1转基因株系的生理氮素利用效率(PNUE)和氮素回收指数(NHI)在正常淹水条件下并没有变化,但在控水条件下分别增加了 14.6%和13.2%。