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猪肉是人类摄取动物蛋白的重要来源,优质猪肉细嫩多汁、口感丰富、肉色鲜红,而肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量与其有着极高的关联,因此成为评定肉质的重要指标。人类对猪的长期遗传选育投入了很大的人力和物力,更偏重于降低背膘厚度和提高瘦肉率,然而造成了肌内脂肪含量的大幅下降,甚至高瘦肉型猪IMF含量降到了1.5%(建议范围：2.5%-3%),导致猪肉品质下降、口感变差,因此今后的选育方向转变成在确保瘦肉率的同时增加IMF含量。研究表明,肌内脂肪含量的提高即意味着甘油三酯(triglycerol, TAG)含量的提高。DGAT1限速酶催化甘油三酯合成反应的最后一步,在哺乳动物的脂类代谢中发挥着重要作用。因此,本研究以二酰基甘油酰基转移酶1作为候选基因,构建了肌肉特异性真核表达载体sMCK-sDGAT1,通过显微注射和体细胞克隆分别获得了转基因小鼠和转基因猪,以研究肌肉超表达DGAT1的效果和影响,为今后的研究提供材料并奠定基础。取得的主要研究成果有：1、根据基因重组的原理,从猪MCK基因的细菌人工染色体中,获得了MCK基因长度为7261个碱基的启动子序列。以真核表达载体pEGFP-N1为框架去除GFP基因后,连接MCK基因启动子和人工合成的DGAT1基因全长CDS,构建肌肉特异性超表达DGAT1的真核表达载体sMCK-sDGAT1。采用PCR、酶切和测序的方式进行鉴定,证明最终构建的载体准确无误。2、通过显微注射法将线性化sMCK-sDGAT1注射进入小鼠受精卵的雄原核,我们得到了16只阳性转基因Founder鼠(委托上海南方模式生物科技有限公司),阳性公鼠与阴性C57BL/6J母鼠交配后获得F1代阳性转基因小鼠。采用半定量检测二月龄和四月龄小鼠的DGAT1基因表达量,进行组织表达谱的研究,结果表明相较于阴性小鼠,DAGT1基因在阳性小鼠的骨骼肌和肾脏内高表达,在心肌内中等表达,而在脑,肺,肠等组织内很少表达。上述结果说明MCK基因启动子能够驱动DGAT1基因在哺乳动物体内表达,与对哺乳动物各个组织内MCK基因表达的研究结果是一致的。3、我们通过实时定量PCR检测了骨骼肌中参与脂肪合成和转运等相关基因的表达情况,发现部分基因的表达发生变化,如质体乙酰辅酶羧化酶1(ACC1)的mRNA增加34%(p<0.01),脂肪酸结合蛋白(FABP4)增加53%(p<0.01),脂肪酸合成酶(FAS)增加74%(p<0.01),乙烯前体ACC合成酶1(ACS1)增加62%(p<0.01),骨骼肌中的棕色脂肪特异基因UCP1也增加了74%(p<0.01)。Westen Blot的实验结果表明,DGAT1、ACC1、FABP4和UCP1的蛋白水平也相应的提高了。连续十周测定转DGAT1阳性小鼠与阴性小鼠的体重,数据显示二者差异不显著,说明特异性增加IMF含量,并不会导致小鼠其它组织脂肪的过度沉积和肥胖。测定转DGAT1阳性小鼠骨骼肌中的甘油三酯和脂肪酸,发现二者相对于阴性小鼠分别增加了35.5%(p<0.01)和20.3%(p<0.01)。4、培养了猪30日龄胚胎的原代成纤维细胞系,用电击转染法将线性化的sMCK-sDGAT1片段稳定转染进猪的成纤维细胞,经G418筛选并进行PCR检测后获得阳性单克隆,作为体细胞核移植的供体细胞制备了转基因猪。5、通过PCR及Southern Blot检测确定获得了一头原代阳性转基因猪,内参基因为GAPDH,使用实时荧光定量PCR法检测外源基因DGAT1基因的拷贝数,并通过计算绘制标准曲线,公式为Log2N(拷贝数)=-0.6497ΔCt+4.9372(R2=0.9835,p(0.01),计算得到原代转基因猪外源基因拷贝数为32.893±1.99。